El colesterol elevado es un factor de riesgo importante para las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Nuestros protocolos proporcionan herramientas valiosas para estudiar las consecuencias fisiológicas y mecanicistas de la hipercolesterolemia. Estos procedimientos se pueden realizar utilizando equipos básicos de laboratorio y son aplicables a células, tejidos y ovocitos xenopus.
El colesterol es un componente importante de las membranas celulares en todo el cuerpo. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar el impacto de niveles elevados de colesterol en cualquier tipo de célula. Diseccionar las arterias es el paso más difícil.
Retire cuidadosamente la arteria del cerebro, sin estirar ni dañar el tejido vascular. Los lípidos son muy delicados, y trabajar con ellos es más un arte que una ciencia. La demostración en vídeo proporciona una guía para aprender a manejar los lípidos con cuidado.
Para preparar la solución saturada de colesterol metil-beta-ciclodextrina, primero agregue 064 gramos de metil-beta-ciclodextrina a 10 mililitros de PBS, agitando la solución con una barra de agitación, para asegurar que la metil-beta-ciclodextrina se disuelva por completo. A continuación, agregue 0024 gramos de polvo de colesterol al matraz, y revuelva la solución vigorosamente, utilizando una espátula para romper tantos trozos de colesterol como sea posible. Cuando casi todo el colesterol se haya disuelto, selle el matraz con al menos dos capas de película de parafina.
Y agitar el matraz a unas 30 oscilaciones por minuto en un baño de agua Celsius de 37 grados durante la noche. Después de ocho a 16 horas, enfríe la solución a temperatura ambiente, antes de filtrar la mezcla a través de un filtro de jeringa de poliétersulfone de 22 micrómetros en una botella de clase. Para el enriquecimiento de la arteria cerebral de los mamíferos, cosecha el cerebro de una rata Sprague Dawley de 250 a 300 gramos en un vaso de precipitados de PBS sobre hielo, antes de transferir el cerebro a un tazón de disección encerado, bajo un microscopio desección, que contiene suficiente PBS para sumergir el tejido.
Asegure el cerebro con dos o tres pines, asegurándose de que no penetren los vasos sanguíneos. Y usa fórceps afilados y pequeñas tijeras quirúrgicas para diseccionar suavemente las arterias cerebrales y sus ramas que forman el Círculo de Willis en la base del cerebro. A continuación, enjuague brevemente hasta un centímetro de segmentos de arteria de largo en PBS, antes de incubar los segmentos enjuagados en suficiente solución enriquecedora de colesterol para cubrir los tejidos.
Para determinar cualquier alteración en el nivel de colesterol, utilice una botella fresca de polvo de filipina para preparar una solución de 10 miligramos por mililitro de stock del tinte en dimetil sulfóxido, y lave los tejidos enriquecidos con colesterol con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco. Después del último lavado, fijar los segmentos de la arteria en 4%paraformaldehído durante 15 minutos sobre hielo, protegido de la luz, antes de permeabilizar las muestras en 5%Tritón en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los tejidos con tres lavados de cinco minutos en PBS en una coctelera, antes de añadir las muestras a una concentración final de 25 microgramos por mililitro de solución de tinte filipin, durante una hora a temperatura ambiente, protegida de la luz.
Al final de la incubación, lave las piezas de la arteria tres veces como se ha demostrado, seguido de un breve enjuague con agua destilada. Después del último lavado, usa un tejido de laboratorio para absorber cualquier exceso de líquido, y monta las arterias en un portaobjetos usando un medio de montaje adecuado. Cubra cuidadosamente las arterias con un resbalón de cubierta, teniendo cuidado de evitar rodar o torcer el tejido, y deje que el portaobjetos se seque durante 24 horas a temperatura ambiente, protegido de la luz.
Cuando el medio de montaje esté seco, selle los bordes deslizantes de la cubierta con esmalte de uñas transparente y deje que el esmalte se seque durante 10 a 15 minutos. Luego, imagine el tejido con una excitación de 340 a 380 nanómetros, y una emisión de 385 a 470 nanómetros. Para preparar la dispersión a base de fosfolípidos, combine 200 microlitros de 10 miligramos por mililitro cloroformo cloroformo solución lipricada, L-alfa-fosfatidiletanolamina, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, y colesterol en un tubo de vidrio de 12 mililitros.
Evaporar el cloroformo en la campana bajo una corriente de nitrógeno, antes de suspender los lípidos en 800 microlitros de cloruro de potasio tamponado de 150 mililitros y 10 mililitros de solución Des HEPES. A continuación, selle el tubo con película de parafina y sonice suavemente el contenido del tubo a 80 kilohercios durante 10 minutos, hasta que se forme una mezcla lechosa. Para el enriquecimiento del colesterol de los ovocitos de Xenopus, utilice fórceps afilados para interrumpir el saco ovárico de una rana hembra de Xenopus laevis en múltiples regiones, y coloque los trozos de ovario en una placa de 60 milímetros con cinco mililitros de ND96 libre de calcio complementado con 5 miligramos por mililitro de colágeno.
Agitar el tejido en un agitador orbital a 60 oscilaciones por minuto durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, utilice una pipeta de transferencia con una punta ancha para pipetear vigorosamente el ócito que contiene solución de cinco a 10 veces para aislar los ovocitos individuales, y enjuague rápidamente la solución de ovocitos oscuros con ND96 libre de calcio fresco hasta que la solución se vuelva transparente. A continuación, transfiera 90 microlitros de la dispersión basada en fosfolípidos enriquecidos con colesterol en un pozo de una placa de 96 pozos, y agregue hasta seis ovocitos al pozo con el menor medio posible.
Coloque la placa de 96 pozos en un rotador de plataforma tridimensional durante cinco a 10 minutos. A continuación, agregue una gota de ND96 al pozo, y transfiera los ovocitos enriquecidos con colesterol a una placa de 35 milímetros que contenga ND96 para su análisis inmediato. Aquí, un ejemplo de una capa muscular lisa de la arteria cerebral con imagen demuestra el aumento dependiente de la concentración en la fluorescencia asociada a filipin obtenida al enriquecemiento del tejido con el aumento de las concentraciones de colesterol.
En particular, tres horas después del tratamiento con el complejo de colesterol metil-beta-ciclodextrina los niveles de colesterol disminuyeron en aproximadamente un 50% en comparación con su nivel inmediatamente después del enriquecimiento. Mientras que un tiempo de incubación de una hora se utiliza comúnmente para enriquecer los tejidos y células con colesterol durante este enfoque, cinco minutos de incubación es generalmente suficiente para lograr un aumento estadísticamente significativo en el contenido de colesterol arterial cerebral según lo determinado por el ensayo bioquímico a base de colesterol oxidasa. Aunque no se observa ningún cambio significativo en los niveles de colesterol en los ovocitos de Xenopus enriquecidos con dispersiones basadas en fosfolípidos de control que carecen de colesterol, los niveles de colesterol aumentan significativamente después de sólo cinco minutos de tratamiento con las dispersiones basadas en fosfolípidos que incluyen colesterol, y permanecen en este nivel cuando el tiempo de incubación se incrementa a 60 minutos.
La eficacia del enfoque basado en ciclodextrina para enriquecer las células también se demuestra en las neuronas recién aisladas de la región CA1 del hipocampo. De hecho, la incubación de las neuronas en metil-beta-ciclodextrina saturada con colesterol durante 60 minutos da como resultado un aumento de más de dos veces en los niveles de colesterol, según lo evaluado por la fluorescencia asociada a filipin. En general, los dos pasos más importantes para estos procedimientos son preparar la mezcla de enriquecimiento de colesterol y garantizar la integridad del tejido arterial.
Después del enriquecimiento del colesterol, se puede estudiar la función de las proteínas que se ven afectadas por la hipercolesterolemia. La capacidad de enriquecer las células con colesterol facilitó el estudio de niveles elevados de colesterol en cardiomiocitos y neuronas. El uso de ovocitos nos permitió investigar cómo el colesterol se une a los canales iónicos.
Un abrigo de laboratorio y guantes que siempre se usa para este protocolo. El cloroformo y el paraformaldehído deben utilizarse bajo una campana de humos y desecharse como residuos peligrosos.
