Este protocolo proporciona un método para identificar los interactores de ARN de una proteína de unión al ARN PKR de una manera de todo el genoma. Nos ayuda a entender mejor la regulación post-transcripción de la expresión génica por la proteína de unión al ARN. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un reticulación eficiente del formaldehído para fijar RNase unido a proteínas de unión al ARN y enriquecerlas a través de la inmunoprecipitación.
La PKR activada se observa en pacientes con enfermedad neurodegenerativa, como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Identificar la RNase de doble cadena que interactúa con PKR nos ayudará a comprender mejor la patogénesis de estas enfermedades degenerativas. Este método se puede utilizar para estudiar los interactores de ARN de cualquier proteína de unión al ARN.
En particular, creemos que este método es útil para estudiar proteínas que reconocen la RNase estructurada, como la RNase de doble cadena. Compruebe la homogeneidad de la muestra de ciclo arrestado antes de cosechar las células. Además, es fundamental optimizar la eficiencia de la inmunoprecipitación utilizando el mejor anticuerpo disponible.
Para empezar, sembra 750,000 o un millón de células HeLa para muestras arrestadas en S o M-fase, respectivamente. Crecer células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante 24 horas. Tratar las células con timidina de dos milímetros e incubar a 37 grados centígrados durante 18 horas.
Lave las células dos veces con PBS. Luego, agregue medios nuevos e incubar a 37 grados centígrados durante nueve horas. Para las células arrestadas en fase S, trate las células con timidina de dos mililitros.
Para las células arrestadas en fase M, trate las células con 100 nanogramos por mililitro de nocodazol. Incubar a 37 grados centígrados durante 15 horas. Para una muestra de fase S, recoja las células con un rascador de células y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros.
Para obtener una muestra de fase M, toque el lado de la placa de cultivo celular para separar las células arrestadas en fase M y transfieralas a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 380 g a temperatura ambiente durante tres minutos. Retire el sobrenadante y resusppend las células con un mililitro de PBS frío.
Transfiera las células al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar las células a 10.000 g a cuatro grados centígrados durante 30 segundos, y retire los sobrenadantes por completo. Para realizar la reticulación de formaldehído, primero agregue 750 microlitros de 0.1%paraformaldehído a las células, e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos para fijar las células.
Luego, agregue 250 microlitros de glicina un molar e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales para apagar la reacción. Centrifugar las células a 10.000 g a cuatro grados Celsius durante 30 segundos. Retire los sobrenadantes por completo.
A continuación, resuspend con un mililitro de PBS. Centrifugar las células a 10.000 g a cuatro grados centígrados durante 30 segundos, y retire el sobrenadante. Resuspender con 400 microlitros de tampón de lysis fCLIP complementado con 0.2 volume percent proteasa inhibitor y dos volume percent inhibidor de la RNase.
Incubar sobre hielo durante 10 minutos, y sonicar usando un ultrasonicador. A continuación, agregue 11 microlitros de cloruro sódico de cinco molares para ajustar la concentración de cloruro de sodio a 150 mililitros y vórtice brevemente. Luego, centrifugar a 21, 130 g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos.
Transfiera los sobrenadantes a un tubo de microcentrífuga pre-refrigerado de 1,5 mililitros. Para realizar la inmunoprecipitación, primero agregue 20 microlitros de cuentas de proteína A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, lave las perlas con 400 microlitros de tampón de lylisis fCLIP.
Centrifugar las cuentas a 1.000 g a cuatro grados centígrados durante un minuto. A continuación, retire el sobrenadante, agregue 400 microlitros de tampón de lysis fCLIP con cuidado, y resuspender suavemente las perlas invirtiendo de tres a cuatro veces. Repita el paso de lavado tres veces.
Después del lavado final, retire los sobrenadantes por completo. Resuspender las perlas en 300 microlitros de tónifico de lysis fCLIP. Añadir 8,3 microlitros de cloruro sódico de cinco molares para ajustar la concentración de cloruro de sodio a 150 mililitros.
Añadir 10 microlitros de anticuerpos activados por ARN de proteína quinasa e incubar un rotador a cuatro grados centígrados durante tres horas. A continuación, centrifugar las cuentas a 1.000 g a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire el sobrenadante, agregue 400 microlitros de tampón de lavado fCLIP y resuspender suavemente las perlas invirtiendo de tres a cuatro veces.
Repita el paso de lavado dos veces. Después del lavado final, retire los sobrenadantes por completo. A continuación, agregue 300 microlitros de litato e incubar a cuatro grados centígrados en un rotador durante tres horas.
Luego, centrifuga las cuentas a 1.000 g a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire el sobrenadante, agregue 400 microlitros de tampón de lavado fCLIP y resuspender suavemente las perlas invirtiendo de tres a cuatro veces. Repita el paso de lavado tres veces.
Después del lavado final, retire el sobrenadante por completo. A continuación, agregue 300 microlitros de búfer de elución fCLIP. Incubar en un ThermoMixer a 25 grados Celsius durante tres horas para eluir proteína quinasa RNA-activado de las cuentas.
Centrifugar a 1.000 g a temperatura ambiente, y transfiera los sobrenadantes a un tubo limpio siliconizado. Por último, añadir 300 microlitros de Proteinase K e incubar durante la noche a 65 grados centígrados. La eficiencia de la detención del ciclo celular de las células de HeLa en la fase S o M se examinó utilizando FACS.
El anticuerpo D7F7 mostró una capacidad superior para inmuno precipitar el ARN de la proteína quinasa activado. El análisis de la mancha occidental de inmuno pkR precipitado o el lysato total de HeLa mostró sólo una banda fuerte correspondiente al tamaño de PKR, lo que indica que el anticuerpo D7F7 es muy específico en el reconocimiento de PKR. El uso de diferentes anticuerpos PKR con diferente eficiencia de inmunocir precipitación, dio lugar a una distribución de clase diferente de lecturas de secuenciación de mapas.
Se observó una disminución de la señal de radioisótopo para la RNase inmunopropitada PKR tras la eliminación exitosa del ARNR. La muestra de ARN inmunoeprecipitado PKR mostró un fuerte enriquecimiento de la Rnase mitocondrial en comparación con los controles negativos. Se utilizó la transcripción inversa específica de Strand para distinguir la RNase mitocondrial de hebra pesada y ligera que fueron inmunomunprecipitadas con PKR para células arrestadas por fase S o M.
El paso más crítico en la preparación de la muestra de detención del ciclo celular es donde debe lavar las células dos veces con PBS y donde debe recoger sólo las células pastel para la homogeneidad o sería la muestra deteriorada. Para el proceso ético, los pasos más críticos son el reticulación y la cantidad de formaldehído. Después de este procedimiento, los ARN eluidos se pueden analizar usando la hinchazón del norte, el PCR qRT o la secuenciación de alto rendimiento.
Estos experimentos pueden identificar el tipo y la cantidad relativa de RNase enlazado a PKR. Esta técnica se puede aplicar para estudiar e identificar los interactores de ARN de las proteínas de unión al ARN que mejorarán nuestra comprensión de la regulación post transcripcional de la expresión génica, mediada por proteínas de unión al ARN. El formaldehído es peligroso, por lo que la fijación, la solución y el tampón de lavado inicial deben manipularse con precaución.
