Este método permite compartimentar cada arco faríngeo. Los números de células endoteliales se pueden cuantificar en cada arco como un medio para estudiar el desarrollo de la arteria del arco faríngeo. Las principales ventajas de este enfoque son la capacidad de visualizar la relación entre diferentes estructuras vasculares y la capacidad de determinar cuantitativamente cómo las estructuras afectaron a los mutantes.
Las arterias del arco aórtico suelen mutarse en la cardiopatía congénita. Nuestro método permite el estudio de cómo las mutaciones alteran el proceso fisiológico de formación y remodelación de los vasos. Aunque utilizamos este método para obtener información sobre los mecanismos de las enfermedades cardíacas congénitas, se puede aplicar a otros sistemas particularmente con la llegada de la microscopía de láminas de luz.
Comience usando una pipeta de vidrio para transferir cada ratón embrionario 9.5 o 10.5 embrión a dos tubos individuales de dos mililitros que contienen un mililitro de PBS. Después de la fijación, utilice fórceps finos para pellizcar cuidadosamente el embrión justo por encima de la extremidad posterior y hacer un corte transversal para eliminar la mitad posterior del embrión. Para permeabilizar los embriones, reemplace el PBS con PBST y coloque los embriones en cuatro grados Celsius con agitación suave durante la noche.
Al día siguiente, reemplace el PBST con 600 microlitros de tampón de bloqueo sin tocar los embriones durante una incubación de 16 a 18 horas a cuatro grados centígrados con agitación suave. A la mañana siguiente, reemplace el tampón de bloqueo con 600 microlitros del anticuerpo primario de interés por tubo para una incubación de cuatro a cinco días a cuatro grados centígrados con agitación suave. Al final de la incubación, lave los embriones en un mililitro de PBST durante cuatro a cinco horas con agitación suave a temperatura ambiente cambiando el PBS cada hora, seguido de una incubación nocturna en PBST fresco a cuatro grados centígrados y de cuatro a cinco lavados adicionales de una hora al día siguiente.
Después del último lavado, reemplace el PBST en cada tubo con 600 microlitros de la solución de anticuerpos secundaria apropiada para una incubación de cuatro a cinco días a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave los embriones en un mililitro de PBST fresco por lavado como se acaba de demostrar y utilice una pipeta de vidrio para transferir suavemente cada embrión a moldes de parafina de plástico individuales. Retire cuidadosamente cualquier PBST alrededor de cada embrión y oriente cada embrión en una posición sagital.
A continuación, agregue rápidamente unos 500 microlitros de agarosa caliente a cada molde hasta que cada embrión esté cubierto y coloque los moldes sobre hielo cubierto con papel de aluminio hasta que la agarosa se haya solidificado. Para la deshidratación de las muestras embrionarias, utilice un bisturí limpio para cortar un bloque de agarosa alrededor de cada embrión y utilice fórceps para agarrar la agarosa para transferirla a un tubo de dos mililitros etiquetado que contenga un mililitro de metanol al 25%. Después de una incubación de una hora con agitación suave en la oscuridad, reemplace 25%metanol con un mililitro de 50%metanol por tubo para una incubación adicional de una hora en la oscuridad.
Después del final de la deshidratación, reemplace el 100% metanol por un mililitro de 50%BABB para una incubación de una hora con agitación suave en la oscuridad. Al final de la incubación, reemplace el 50%BABB por un mililitro de 100%BABB por tubo para una incubación de una hora con agitación suave en la oscuridad, seguido de una segunda incubación con 100% BABB como acaba de demostrar. Para montar los embriones para la toma de imágenes, retire el adhesivo de un parachoques de pozo rápido y coloque el parachoques en un cubreobjetos de vidrio de 24 por seis mililitros de 1,5.
Aplique una presión suave al adhesivo para eliminar cualquier burbuja de aire entre el cubreobjetos y el parachoques y deseche cuidadosamente el 100% BABB de cada tubo. A continuación, utilice fórceps finos para transferir cuidadosamente el embrión al pozo rápido sin tocar el embrión y colocar un segundo cubreobjetos en el parachoques. Para mostrar el endotelio en todo el tercer arco faríngeo, abra la imagen de interés en el software y haga clic en Añadir nueva superficie.
Haga doble clic en la superficie uno y cambie el nombre de la nueva superficie a tercer arco faríngeo. Seleccione Omitir creación automática, editar manualmente y establecer la orientación de la superficie en el plano YZ. Utilice la posición de la rebanada para colocar el tercer plano de superficie del arco faríngeo a donde se conectan la tercera PAA y la aorta dorsal.
Gire la imagen para que el tercer plano de superficie del arco faríngeo esté a la vista y desactive la cortadora ortogonal. En el modo de curva de nivel de dibujo, seleccione la función de modo de dibujo de distancia y ajuste la configuración de parámetros según sea necesario. Una vez establecidos todos los parámetros, pulse la tecla Escape y haga clic en Draw para trazar el perímetro del tercer arco faríngeo con el cursor del ratón.
A continuación, utilice la posición de la rebanada para mover de 10 a 25 rebanadas y trazar el perímetro del arco faríngeo. Cuando se haya trazado todo el arco, haga clic en crear superficie para generar la superficie de la región trazada. Para enmascarar las estructuras con superficie, en el menú de edición, seleccione la selección de máscara para el tercer PAA y DAPI y haga clic en Aceptar. A continuación, cambie el nombre del nuevo canal como PAA DAPI.
Repita este paso para los canales restantes. Para visualizar el plexo endotelial por separado del PAA, seleccione la selección de máscara para el tercer PAA y seleccione DAPI. Desactive seleccionar voxels fuera de la superficie y marque seleccionar voxels dentro de la superficie.
Establezca seleccionar vóxeles dentro de la superficie en cero y haga clic en Aceptar. Cambie el nombre del nuevo canal como DAPI que no sea PAA. Repita este paso para los canales restantes. Seleccione la selección de máscara para el tercer PA y seleccione DAPI que no sea PAA y haga clic en Aceptar. Cambie el nombre del nuevo canal como plexus DAPI.
Repita este paso para los canales restantes. Para cuantificar las celdas endoteliales individuales dentro de cada estructura de interés, en el panel de ajustes de visualización, desactive todos los canales excepto el canal PAA ERG. En el menú de propiedades, haga clic en Agregar nuevos puntos y haga clic para cambiar el nombre de las manchas de un número total de celdas endoteliales PAA.
Haga clic en la flecha azul y seleccione el canal PAA ERG para el canal de origen. Ajuste el diámetro XY estimado a cuatro micrómetros y haga clic en la flecha azul para pasar al siguiente panel. Utilice la escala deslizante para ajustar el número de puntos para asegurarse de que cada núcleo celular endotelial positivo ERG esté representado por un punto.
A continuación, haga clic en la flecha doble verde y desactive el canal PAA ERG en el panel de ajuste de la pantalla. Encienda el canal PAA VEGFR2 para visualizar el endotelio PAA y haga clic en editar y agregar/eliminar para seleccionar la superficie del objeto. Luego presione Escape y mantenga presionada la tecla Mayús para eliminar los puntos que no sean VEGFR2 positivos y haga clic en la pestaña de estadísticas para determinar el número total de celdas endoteliales.
La inmunofluorescencia de montaje completo produce resultados claros y limpios que permiten la reconstrucción 3D del arco faríngeo endotelio. En esta imagen, la presencia de los grandes puntos brillantes es el resultado de partículas en las soluciones de anticuerpos o tampón de bloqueo. Después de la tinción de superficie de arco faríngeo y PAA, el uso de la función de máscara permite separar visualmente las regiones de superficie y analizarse de forma independiente.
El enmascaramiento también permite el análisis individual y la cuantificación de números de células endoteliales dentro de cada estructura. Por ejemplo, aquí se utilizó la entidad de punto para cuantificar el número total de células endoteliales tanto en el PAA como en el plexo asignando un único punto para cada núcleo que expresa el ERG. En esta imagen, se puede observar un punto negativo VEGFR2 positivo ERG que ha sido generado por la función spot.
Por lo tanto, es esencial verificar que cada punto reconocido por el software realmente representa una sola célula endotelial. Para obtener imágenes limpias y claras, recuerde girar hacia abajo todas las soluciones y lavar adecuadamente y a fondo cada embrión después de las incubaciones de anticuerpos. Es importante recordar que BABB es corrosivo y tóxico.
Manipule y deseche el disolvente correctamente y asegúrese de sellar completamente los embriones derretidos para evitar fugas de BABB.
