Questo metodo consente di compartimentare ogni arco faringeo. I numeri delle cellule endoteliali possono quindi essere quantificati in ogni arco come mezzo per studiare lo sviluppo dell'arteria dell'arco faringeo. I principali vantaggi di questo approccio sono la capacità di visualizzare la relazione tra le diverse strutture vascolari e la capacità di determinare quantitativamente come le strutture hanno influenzato i mutanti.
Le arterie ad arco aortico sono comunemente mutate nelle malattie cardiache congenite. Il nostro metodo consente lo studio di come le mutazioni alterano il processo fisiologico di formazione e rimodellamento dei vasi. Sebbene usiamo questo metodo per ottenere informazioni sui meccanismi delle malattie cardiache congenite, può essere applicato ad altri sistemi in particolare con l'avvento della microscopia a fogli di luce.
Iniziare utilizzando una pipetta di vetro per trasferire ogni giorno embrionale di topo 9.5 o 10.5 embrione in singoli due tubi millilitro contenenti un millilitro di PBS. Dopo la fissazione, utilizzare le forcep fini per pizzicare con cura l'embrione appena sopra l'arto posteriore e fare un taglio trasversale per rimuovere la metà posteriore dell'embrione. Per permeabilizzare gli embrioni, sostituire il PBS con PBST e posizionare gli embrioni a quattro gradi Celsius con delicata agitazione durante la notte.
Il giorno successivo, sostituire il PBST con 600 microlitri di tampone di blocco senza toccare gli embrioni per un'incubazione da 16 a 18 ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione. La mattina seguente, sostituire il tampone di blocco con 600 microlitri dell'anticorpo primario di interesse per tubo per un'incubazione da quattro a cinque giorni a quattro gradi Celsius con delicata agitazione. Alla fine dell'incubazione, lavare gli embrioni in un millilitro di PBST per quattro o cinque ore con agitazione delicata a temperatura ambiente che cambia il PBS ogni ora, seguita da un'incubazione notturna in PBST fresco a quattro gradi Celsius e da quattro a cinque lavaggi aggiuntivi di un'ora il giorno successivo.
Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBST in ogni tubo con 600 microlitri della soluzione anticorpale secondaria appropriata per un'incubazione da quattro a cinque giorni a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare gli embrioni in un millilitro di PBST fresco per lavaggio come appena dimostrato e utilizzare una pipetta di vetro per trasferire delicatamente ogni embrione in singoli stampi di paraffina di plastica. Rimuovere con cura qualsiasi PBST da ogni embrione e orientare ogni embrione in posizione sagittale.
Quindi aggiungere rapidamente circa 500 microlitri di agarosio caldo ad ogni stampo fino a quando ogni embrione non è appena coperto e posizionare gli stampi sul ghiaccio coperto di foglio di alluminio fino a quando l'agarosio non si è solidificato. Per la disidratazione dei campioni embrionali, utilizzare un bisturi pulito per tagliare un blocco di agarosio intorno a ciascun embrione e utilizzare le forcep per afferrare l'agarosio per il trasferimento in un tubo etichettato con due millilitri contenente un millilitro di 25%metanolo. Dopo un'incubazione di un'ora con delicata agitazione al buio, sostituire il 25% di metanolo con un millilitro di 50%metanolo per tubo per un'ulteriore incubazione di un'ora al buio.
Dopo la fine della disidratazione, sostituire il 100% di metanolo con un millilitro del 50%BABB per un'incubazione di un'ora con delicata agitazione al buio. Al termine dell'incubazione, sostituire il 50%BABB con un millilitro di 100%BABB per tubo per un'incubazione di un'ora con delicata agitazione al buio, seguita da una seconda incubazione con 100%BABB come appena dimostrato. Per montare gli embrioni per l'imaging, rimuovere l'adesivo da un paraurti veloce e posizionare il paraurti su un coprispazzo di vetro 24 per sei millilitri numero 1.5.
Applicare una leggera pressione sull'adesivo per rimuovere eventuali bolle d'aria tra la coverlip e il paraurti e scartare con cura il 100%BABB da ogni tubo. Quindi utilizzare forcep fini per trasferire con cura l'embrione nel pozzo veloce senza toccare l'embrione e posizionare un secondo coverslip sul paraurti. Per far emergere l'endotelio nell'intero terzo arco faringeo, aprire l'immagine di interesse per il software e fare clic su aggiungi nuova superficie.
Fate doppio clic sulla superficie uno e rinominare la nuova superficie in terzo arco faringeo. Selezionate salta creazione automatica (Skip automatic creation), modificate manualmente e impostate l'orientamento della superficie sul piano YZ. Utilizzare la posizione della fetta per posizionare il terzo piano superficiale dell'arco faringeo dove si collegano il terzo PAA e l'aorta dorsale.
Ruotare l'immagine in modo che il terzo piano della superficie dell'arco faringeo sia in vista e disattivare l'orto sezionatore. In modalità contorno disegno, selezionate la funzione modalità di disegno a distanza e regolate le impostazioni dei parametri in base alle esigenze. Una volta impostati tutti i parametri, premere ESC e fare clic su disegno per tracciare il perimetro del terzo arco faringeo con il cursore del mouse.
Quindi utilizzare la posizione della fetta per spostare da 10 a 25 fette e tracciare il perimetro dell'arco faringeo. Una volta tracciato l'intero arco, fate clic su crea superficie (Create Surface) per generare la superficie della regione tracciata. Per mascherare le strutture superfici, nel menu modifica selezionate la selezione della maschera per il terzo PAA e DAPI e fate clic su OK. Rinominare quindi il nuovo canale come PAA DAPI.
Ripetere questo passaggio per i canali rimanenti. Per visualizzare il plesso endoteliale separatamente dal PAA, selezionare la selezione della maschera per il terzo PAA e selezionare DAPI. Deselezionate selezionare voxel esterni alla superficie e selezionare voxel all'interno della superficie.
Impostare voxel selezionati all'interno della superficie su zero e fare clic su OK. Rinominare il nuovo canale come DAPI non PAA. Ripetere questo passaggio per i canali rimanenti. Selezionare la selezione della maschera per la terza PA e selezionare DAPI non PAA e fare clic su OK. Rinominare il nuovo canale come DAPI inplexus.
Ripetere questo passaggio per i canali rimanenti. Per quantificare le singole cellule endoteliali all'interno di ogni struttura di interesse, nel pannello di regolazione del display, spegnere tutti i canali ad eccezione del canale PAA ERG. Nel menu delle proprietà fare clic su Aggiungi nuovi punti e fare clic per rinominare le macchie di un numero totale PAA di celle endoteliali.
Fare clic sulla freccia blu e selezionare il canale PAA ERG per il canale di origine. Regolare il diametro XY stimato a quattro micrometri e fare clic sulla freccia blu per passare al pannello successivo. Utilizzare la scala mobile per regolare il numero di punti per garantire che ogni nucleo di cellule endoteliali positive ERG sia rappresentato da un punto.
Fare quindi clic sulla doppia freccia verde e disattivare il canale PAA ERG nel pannello di regolazione dello schermo. Attivate il canale PAA VEGFR2 per visualizzare l'endotelio PAA e fate clic su modifica e aggiunge/elimina (Edit and add/delete) per selezionare la superficie dell'oggetto. Quindi premere ESC e tenere premuto MAIUSC per eliminare eventuali punti non positivi a VEGFR2 e fare clic sulla scheda statistiche per determinare il numero totale di celle endoteliali.
L'immunofluorescenza a montaggio intero produce risultati chiari e puliti che consentono la ricostruzione 3D dell'endotelio ad arco faringeo. In questa immagine, la presenza dei grandi punti luminosi è il risultato di particolato nelle soluzioni anticorpali o tampone di blocco. Dopo l'arco faringeo e la colorazione superficiale PAA, l'uso della funzione maschera consente di separare visivamente e analizzare in modo indipendente le regioni superficiali.
Il mascheramento consente anche l'analisi individuale e la quantificazione dei numeri di cellule endoteliali all'interno di ogni struttura. Ad esempio, qui la caratteristica spot è stata utilizzata per quantificare il numero totale di cellule endoteliali sia nel PAA che nel plesso assegnando un singolo punto per ogni nucleo che esprime ERG. In questa immagine, si può osservare una macchia negativa VEGFR2 positiva ERG generata dalla funzione spot.
Pertanto, è essenziale verificare che ogni punto riconosciuto dal software rappresenti effettivamente una singola cella endoteliale. Per ottenere immagini pulite e chiare, ricorda di far girare giù tutte le soluzioni e di lavare correttamente e accuratamente ogni embrione dopo le incubazioni di anticorpi. È importante ricordare che BABB è corrosivo e tossico.
Maneggiare e scartare correttamente il solvente e assicurarsi di sigillare completamente gli embrioni fusi per evitare perdite di BABB.
