이 방법을 사용하면 각 인두 아치를 구획화할 수 있습니다. 내피 세포 수는 인두 아치 동맥 발달을 연구하는 수단으로 각 아치에서 정량화 될 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 다른 혈관 구조 간의 관계를 시각화하는 능력과 구조가 돌연변이에 어떻게 영향을 미쳤는지 정량적으로 결정하는 능력입니다.
대동맥아치동맥은 선천성 심장질환으로 일반적으로 변류됩니다. 우리의 방법은 돌연변이가 혈관 형성 및 리모델링의 생리적 과정을 어떻게 변화시키는지에 대한 연구를 허용합니다. 우리는 선천성 심장병의 기계장치에 통찰력을 얻기 위하여 이 방법을 이용하더라도, 특히 광시트 현미경 검사법의 출현과 함께 그밖 시스템에 적용될 수 있습니다.
유리 파이펫을 사용하여 각 마우스 배아일 9.5 또는 10.5 배아를 PBS의 1 밀리리터를 포함하는 개별 2개의 밀리리터 튜브로 옮기는 것으로 시작합니다. 고정 후, 미세 한 집게를 사용하여 뒷다리 바로 위에 배아를 조심스럽게 꼬집어 배아의 후방 절반을 제거하기 위해 횡선을 절단하십시오. 배아를 과립시키기 위해 PBS를 PBST로 대체하고 배아를 섭씨 4도에 배치하여 밤새 부드러운 동요로 놓습니다.
다음 날, PBST를 600 마이크로리터의 블로킹 버퍼로 교체하여 16~18시간 배양을 위한 배아를 4°C에서 부드러운 교반으로 만지지 않고 다이징을 만지지 않습니다. 다음 날 아침, 블로킹 버퍼를 튜브당 1차 관심사 항체의 600 마이크로리터로 교체하여 4~5일 간 분비식을 완만하게 교반한다. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 부드러운 동요로 4~5시간 동안 PBST1밀리리터로 배아를 세척하고, 다음 날 4~5시간 세척시 신선한 PBST에서 하룻밤 을 배양합니다.
마지막 세척 후, 4~5일 잠복식을 위해 각 튜브의 PBST를 적절한 이차 항체 용액의 600 마이크로리터로 교체하십시오. 인큐베이션이 끝나면, 배아를 세척당 신선한 PBST 1밀리리터로 씻고 유리 파이펫을 사용하여 각 배아를 개별 플라스틱 파라핀 몰드로 부드럽게 옮겨냅니다. 각 배아 주위에서 PBST를 조심스럽게 제거하고 각 배아를 경각선 자세로 지향합니다.
그런 다음 각 배아가 막 덮을 때까지 각 금형에 약 500 마이크로리터를 넣고 아가로즈가 고화될 때까지 알루미늄 호일로 덮인 얼음에 금형을 놓습니다. 배아 샘플의 탈수의 경우 깨끗한 메스를 사용하여 각 배아 주위에 아가로즈 블록을 자르고 집게를 사용하여 아가로즈를 파악하여 25%의 메탄올 1밀리리터를 함유한 라벨이 부착된 2밀리리터 튜브로 이송합니다. 어둠 속에서 부드러운 동요와 1 시간 배양 후, 어둠 속에서 추가 1 시간 배양에 대한 튜브 당 50 %의 메탄올의 1 밀리리터로 25 %의 메탄올을 교체합니다.
탈수가 끝난 후 100% 메탄올을 50%BABB의 1밀리리터로 바흑에서 부드러운 교반으로 1시간 동안 바꿔보겠습니다. 인큐베이션이 끝나면 50%BABB를 튜브당 1밀리리터1밀리리터로 1시간 동안 튜브당 1밀리리터로 바흑에서 부드러운 교반으로 교체하고, 두 번째 인큐베이션은 100%BABB로 바릅니다. 이미징용 배아를 장착하려면 빠른 웰 범퍼에서 접착제를 제거하고 범퍼를 24x6 밀리리터 번호 1.5 유리 커버슬립에 놓습니다.
접착제에 부드러운 압력을 가하여 커버슬립과 범퍼 사이의 기포를 제거하고 각 튜브에서 100% BABB를 조심스럽게 폐기하십시오. 그런 다음 미세 한 집게를 사용하여 배아를 건드리지 않고 배아를 빠르게 빠르게 옮기고 범퍼에 두 번째 커버 슬립을 놓습니다. 전체 세 번째 인두 아치에서 내신을 표면화하려면 소프트웨어에 대한 관심 이미지를 열고 새 표면을 추가클릭합니다.
표면 을 두 번 클릭하고 새 표면의 이름을 세 번째 인두 아치로 바꿉니다. 자동 생성건너뛰기를 선택하고 수동으로 편집하고 표면 방향을 YZ 평면으로 설정합니다. 슬라이스 위치를 사용하여 세 번째 인두 아치 표면 평면을 세 번째 PAA 및 등갈 대자가 연결하는 위치에 배치합니다.
세 번째 인두 아치 표면 평면이 보기에 있고 장교 슬라이서를 끌 도록 이미지를 회전합니다. 그리기 윤곽 모드에서 거리 그리기 모드 함수를 선택하고 필요에 따라 매개 변수 설정을 조정합니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 이스케이프 키를 누르고 그리기를 클릭하여 마우스 커서로 세 번째 인두 아치의 둘레를 추적합니다.
그런 다음 슬라이스 위치를 사용하여 10~25개의 슬라이스를 이동하고 인두 아치의 둘레를 추적합니다. 전체 아치를 추적한 경우 서피스를 클릭하여 추적된 영역의 표면을 생성합니다. 표면 구조의 마스킹을 위해 편집 메뉴에서 세 번째 PAA 및 DAPI에 대한 마스크 선택을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 새 채널의 이름을 PAA DAPI로 바꿉니다.
나머지 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 내피 신경총을 PAA와 별도로 시각화하려면 세 번째 PAA에 대한 마스크 선택을 선택하고 DAPI를 선택합니다. 표면 외부의 복셀 선택 여부를 확인하고 표면 내부의 선택 복셀을 확인합니다.
표면 내부의 선택 복셀을 0으로 설정하고 확인을 클릭합니다. 새 채널의 이름을 PAA 가 아닌 DAPI로 바꿉니다. 나머지 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 세 번째 PA에 대한 마스크 선택을 선택하고 PAA DAPI가 아닌 것을 선택하고 확인을 클릭합니다. 새 채널의 이름을 신경총 DAPI로 변경합니다.
나머지 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 관심있는 각 구조 내에서 개별 내피 세포를 정량화하려면, 디스플레이 조정 패널에서, PAA ERG 채널을 제외한 모든 채널을 끕니다. 속성 메뉴에서 새 반점을 추가하고 클릭하여 PAA 총 내피 셀 수의 이름을 변경합니다.
파란색 화살표를 클릭하고 소스 채널의 PAA ERG 채널을 선택합니다. 예상 XY 직경을 4 마이크로미터로 조정하고 파란색 화살표를 클릭하여 다음 패널로 진행합니다. 슬라이딩 스케일을 사용하여 각 ERG 양성 내피 세포 핵이 한 자리로 표현되도록 반점 수를 조정합니다.
다음으로 녹색 이중 화살표를 클릭하고 디스플레이 조정 패널에서 PAA ERG 채널을 끕니다. PAA VEGFR2 채널을 켜서 PAA 내분비함을 시각화하고 편집 및 추가/삭제를 클릭하여 개체 표면을 선택합니다. 그런 다음 이스케이프를 누르고 시프트를 눌러 VEGFR2 가 아닌 모든 반점을 삭제하고 통계 탭을 클릭하여 내피 세포의 총 수를 결정합니다.
전체 마운트 면역 형광은 인두 아치 내피의 3D 재건을 허용하는 명확하고 깨끗한 결과를 생성합니다. 이 이미지에서, 큰 밝은 점의 존재는 항체 또는 차단 완충액 중 하나에서 미립자의 결과입니다. 인두 아치와 PAA 표면 염색 후, 마스크 기능을 사용하면 표면 영역을 시각적으로 분리하고 독립적으로 분석할 수 있습니다.
마스킹은 또한 각 구조 내에서 내피 세포 수의 개별 분석 및 정량화를 허용한다. 예를 들어, 여기서 스팟 피쳐는 ERG를 발현하는 각 핵에 대해 단일 지점을 할당하여 PAA와 신경총 모두에서 내피 세포의 총 수를 정량화하는 데 사용되었다. 이 이미지에서, 스팟 함수에 의해 생성된 ERG 양성 VEGFR2 음수 점을 관찰할 수 있다.
따라서 소프트웨어에서 인식하는 각 점이 실제로 단일 내피 셀을 나타내는지 확인하는 것이 필수적입니다. 깨끗하고 선명한 이미지를 얻으려면 모든 솔루션을 회전시키고 항체 배양 후 각 배아를 적절하고 철저하게 세척해야합니다. BABB는 부식성이 있고 독성이 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
용매를 제대로 처리하고 폐기하고 BABB 누출을 방지하기 위해 용융 된 배아를 완전히 밀봉해야합니다.
