La creciente evidencia sugiere el impacto de la señalización de estrógeno en la parte colónica de la fisiología, la inmunohistoquímica es una técnica prometedora para identificar los receptores de estrógeno en el colon y evolucionan en colitis. Presentamos un protocolo completo y validado para la visualización inmunohistoquímica de receptores de estrógeno en el colon, utilizando inmunofluorescencia. Junto con la Dra. Sylwia Michlewska del Laboratorio de Imagen Microscópica de la Universidad de Lodz, demostraremos el procedimiento.
Coloque el colon en un plato de petri. Corta los dos puntos en fragmentos de uno a dos centímetros. Coloque cada fragmento sobre una esponja en un casete histológico debidamente etiquetado.
Coloque un cassette que contenga un fragmento de dos puntos en 4%paraformaldehído. Incubar durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados. Preparar y programar el procesador de tejidos durante una hora de incubación en 50%70%90%95%y 100%etanol, xileno 100%etanol, y xileno solamente, así como durante al menos tres horas de incubación en parafina líquida.
Transfiera el fragmento de colon a una caja histológica. Coloque la caja en el procesador de tejidos preprogramado y ejecute el procesador. Después de la incubación en el procesador de tejido, retire el colon de la caja histológica y coloque el fragmento de colon en un molde metálico, de modo que los dos extremos del colon estén en posición vertical.
Llene un tercio del molde con parafina líquida. Coloque el molde en el área de enfriamiento a menos cinco grados centígrados durante unos segundos y luego mueva el molde a la zona de calentamiento a 70 grados centígrados. A continuación, coloque el molde en la parte inferior de la caja histológica y cubra todo el fragmento de colon con parafina líquida.
Coloque el molde metálico que contiene el fragmento de colon y la parafina en el área de enfriamiento durante unos minutos. A continuación, retire el molde metálico del bloque de colon y parafina. Incubar el bloque de colon y parafina durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, eliminar el exceso de parafina del bloque. Inserte el bloque de colon y parafina en un microtomo rotativo totalmente automatizado. Corte el fragmento de colon en secciones de cinco micrómetros.
Transfiera una sección de dos puntos a un baño de agua, precalentado a 40 grados centígrados. Utilice el portaobjetos de vidrio etiquetado para retirar la sección de colon del baño de agua e incubar el tobogán de vidrio a temperatura ambiente durante 24 horas. Primero, retire la parafina incubando el portaobjetos de vidrio en xileno durante cinco minutos.
Repita este paso tres veces. A continuación, coloque el portaobjetos de vidrio en una mezcla uno a uno de xileno y 100% etanol durante cinco minutos. Repita este paso tres veces.
Utilice una serie de concentraciones de etanol decrecientes para rehidratar la sección del colon. Sumerja el tobogán en etanol durante cinco minutos. Repita tres veces en cada concentración antes de pasar a la siguiente concentración.
Enjuague el tobogán de vidrio con agua corriente durante cinco minutos. Recalentar el búfer de recuperación de antígenos a 95 a 98 grados centígrados. A continuación, caliente el portaobjetos de vidrio en solución de recuperación de antígenos hirviendo durante 10 minutos.
Para evitar el desperdicio de reactivos, utilice una pluma hidrófoba para dibujar un círculo alrededor de la sección del colon. Luego, incubar el tobogán durante 10 minutos en una solución del 3% de hidrógeno peroxidasa y agua. Lave el portaobjetos en una solución de lavado durante cinco minutos.
A continuación, incubar el portaobjetos en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Retire la solución de bloqueo y añada de 20 a 50 microlitros de anticuerpo primario contra E-R alfa, E-R beta o G-P-E-R diluidos. Incubar el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Retire la solución de anticuerpos. Lave el portaobjetos tres veces en la solución de lavado durante cinco minutos cada vez. A continuación, agregue un anticuerpo secundario diluido.
Incubar el portaobjetos con anticuerpos secundarios conjugados con tinte durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire la solución de anticuerpos secundaria de la diapositiva. Lave el portaobjetos tres veces en la solución de lavado durante cinco minutos cada vez.
Añadir fluorocromo diluido para la visualización de la membrana e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire la solución y lave el portaobjetos tres veces en la solución de lavado durante cinco minutos cada vez. Agregue unas gotas de DAPI líquido a base de glicerol, un fluorocromo para la visualización de núcleos celulares, directamente en la sección del colon.
Cúbralo cuidadosamente con una corredera de cubierta. Incubar la sección del colon durante al menos 24 horas a cuatro grados centígrados. Analice la sección de colon bajo un microscopio confocal con objetivos 20x o 63x e inmersión en aceite.
La especificidad de los anticuerpos utilizados en el estudio se validó utilizando células MCF-7. Los anticuerpos del receptor de estrógenos permitieron la detección de receptores de estrógeno nucleares E-R alfa y E-R beta, así como el receptor de estrógeno ligado a la membrana G-P-E-R. También se realizó un control negativo en el que las células MCF-7 se tiñeron sólo con anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo y un líquido a base de glicerol con DAPI.
Se encontró una señal citoplasmático fuerte de E-R alfa en las secciones de colon obtenidas de ratones de control y de ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBS. Sin embargo, sólo los colones obtenidos de ratones de control tenían E-R alfa localizado en el citoplasma de células de copa. La microscopía confocal también reveló la localización citoplasmático de E-R beta en las secciones de colon tanto de control como en los ratones tratados con TNBS.
Del mismo modo, se documentó la localización citoplasmático de G-P-E-R en las secciones de colon obtenidas a partir de ratones de control y ratones tratados con TNBS. El posicionamiento correcto de los dos puntos en el molde es esencial para generar la sección transversal correcta. El fluorocromo debe seleccionarse por su propio espectro de excitación y emisión.
Este método también se puede aplicar a otras proteínas que pueden estar implicadas en el desarrollo de la colitis. La detección inmunohistoquímica por inmunofluorescencia se puede extender para manchar otras proteínas en estado de dirección proteína-proteína.
