Este protocolo para la localización de inmunofluorescencia in vivo, o IVIL, evalúa la biodistribución in vivo de anticuerpos diagnósticos y terapéuticos o agentes basados en anticuerpos para la investigación, detección y tratamiento del cáncer. A diferencia de la tinción inmunofluorescente convencional donde la expresión celular de antígenos se revela ex vivo, el método IVIL aclara cómo se distribuyen los anticuerpos y los agentes basados en anticuerpos en el animal vivo. Este video ayudará a comprender el flujo de trabajo general del método IVIL.
Muestra detalles importantes para la reproducción exitosa del protocolo para otras aplicaciones y anticuerpos. Observe los ratones del modelo de cáncer deseado para el crecimiento tumoral adecuado a través de la palpación o la medición de la pinza antes de continuar. Purify conejo anti-ratón B7-H3 y conejo IgG isotip control anticuerpos en una columna de desalado para eliminar conservantes y tampones de almacenamiento siguiendo las instrucciones del fabricante.
Dosis alícuotas de 33 microgramos de cada conjugado de anticuerpos en tubos de microcentrífuga individuales. Después de la anestesia como se describe en el protocolo de texto, prepararse para la inoculación de la vena de cola de las soluciones de anticuerpos. Desinfectar la cola del animal limpiando tres veces con una toallita de alcohol.
Dilate las venas de la cola calentando con una almohadilla de calor durante aproximadamente 30 segundos. Evite calentar todo el animal. Usando un catéter de vena de cola de calibre 27, inserte la aguja de mariposa en una de las dos venas laterales de la cola.
Visualice el flujo de sangre en el catéter para asegurarse de que la aguja está colocada correctamente de modo que las soluciones entren completamente en el animal en comparación con ser capturado en la cola. Utilice un trozo de cinta quirúrgica para fijar cuidadosamente la cola con la aguja insertada al escenario. Enjuague el catéter con 25 microlitros de solución salina estéril tamponada con fosfato.
A continuación, inyecte la solución de anticuerpos en el catéter utilizando jeringas de insulina. Enjuague el catéter una vez más con 25 microlitros de PBS estéril. Retire la aguja de la cola y aplique presión para detener cualquier sangrado.
Realizar la eutanasia humana del ratón como se describe en el protocolo de texto, y poner el ratón en la posición supina. Use tijeras quirúrgicas y fórceps para extirpar los tejidos tumorales. Usa fórceps para agarrar solo la capa externa de la piel entre el conjunto de glándulas mamarias más cercanas a la cola, y haz una pequeña incisión con un par de tijeras quirúrgicas.
Introducir las tijeras cerradas en el corte, y abrir lentamente la punta para separar cuidadosamente la piel de la membrana de la pared abdominal subyacente, manteniéndola intacta. Hacer una incisión vertical en el abdomen, continuando separando la piel de la membrana interna. Entre la tercera y la cuarta glándula mamaria, hacer un corte horizontal a través del abdomen para permitir la retracción de la piel y la visualización de las glándulas mamarias.
Agarrando cada tumor o glándula normal con fórceps, recorta cuidadosamente la piel unida usando tijeras quirúrgicas. Coloque los tejidos extirpados en moldes de base desechables de tejido que estén premarcados y llenos de un medio de incrustación óptimo de la temperatura de corte. Congele rápidamente los moldes colocando sobre hielo seco.
Con el fin de estudiar el parto fuera del objetivo, excúyen otros tejidos u órganos de interés. Usando un criostato, bloques de tejido congelado de sección a 10 micras de espesor, y coloque secciones adyacentes en diapositivas de vidrio de adhesión preetiquetados. Enjuague los portaobjetos de tejido congelado con PBS a temperatura ambiente durante cinco minutos para extraer el medio de incrustación.
Demarcar secciones de tejido con una pluma de barrera hidrófoba para reducir el volumen de soluciones necesarias durante la tinción. Fije las secciones tisulares con una solución de 4%paraformaldehído durante cinco minutos. Después de enjuagar los portaobjetos en PBS durante cinco minutos, permeabilizar las secciones de tejido con 0.5%Triton X-100 en PBS durante 15 minutos.
Enjuague las diapositivas de nuevo en PBS durante cinco minutos. Bloquear los tejidos con PBS que contienen 3% de peso por volumen de albúmina sérica bovina y 5% de volumen de suero de cabra durante una hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar los portaobjetos en PBS durante cinco minutos, incubar las secciones con anticuerpos primarios que mantienen registros, como un marcador nuclear, vascular o citoplasmático común.
Aquí, el CD31 antiratón de rata se utiliza en una dilución de uno a 100 en la solución de bloqueo. Las diapositivas con anticuerpo primario se dejan durante la noche a cuatro grados centígrados, protegidas de la deshidratación en una bandeja deslizante. Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en PBS durante cinco minutos tres veces.
Cambie el PBS cada vez. Incubar las diapositivas con anticuerpos secundarios para etiquetar los anticuerpos primarios. Para esta aplicación, visualice el anticuerpo anti-B7-H3 usando el anticuerpo anti-conejo conjugado de cabra Alexa Fluor 546, y visualice CD31 con anticuerpo secundario anti-rata de cabra Alexa 488 en solución de bloqueo.
Proteja los portaobjetos de la luz y la deshidratación en una bandeja deslizante durante una hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar las diapositivas en PBS como antes, aplique una gota del medio de montaje en el centro de la rebanada de tejido. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos, evitando el atrapamiento de burbujas de aire.
Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y deje secar. Proceda con imágenes de microscopía confocal y análisis cuantitativo de imágenes como se describe en el protocolo de texto. Los micrografos confocales representativos muestran la comparación de anticuerpos específicos B7-H3 conjugados e isotipos inespecíficos de localización conjugada de anticuerpos-ICG en glándulas mamarias murinas que contienen tejidos normales o carcinoma.
Las glándulas mamarias murinas normales de un animal inyectados por vía intravenosa con Iso-ICG o B7-H3-ICG y antimanchas mantenidas con CD31 no muestran manchas de los conjugados de anticuerpos. Se demostró que los tejidos normales no tenían expresión de B7-H3 mediante tinción de inmunofluorescencia ex vivo estándar. En los tumores mamarios invasivos, B7-H3-ICG se une fuertemente a la vasculatura, el primer punto de contacto in vivo, y luego es capaz de extravasar de la vasculatura para manchar heterogéneamente el epitelio tumoral.
Iso-ICG muestra acumulación inespecífica dentro de los tejidos tumorales. La tinción inmunofluorescente ex vivo estándar muestra la expresión uniforme del marcador B7-H3 en células epiteliales y endoteliales. Los micrografos confocales representativos muestran el método de localización de inmunofluorescencia in vivo para detectar la expresión netrin-1 o la expresión de control de isotipo en el carcinoma murino y las glándulas mamarias normales.
La localización de la inmunofluorescencia in vivo confirma la señal epitelial para netrin-1 en tumores MMTV-PyMT, pero no en las glándulas mamarias normales. Además, hay una fuerte señal netrin-1 en las células endoteliales en los tumores mamarios, como lo indica la señal amarilla colocada. La señal es significativamente más débil en las glándulas mamarias normales.
El método IVIL deberá optimizarse en términos de dosificación de anticuerpos, tiempo de recolección de tejido y dilución secundaria de anticuerpos para una implementación exitosa. IVIL permite la focalización de epítopos conformacionales que no se pueden detectar mediante tinción de inmunofluorescencia estándar, que requiere procesamiento de tejido. Además, se pueden recolectar órganos sanos de ratones portadores de tumores para evaluar la administración fuera de la diana de anticuerpos terapéuticos.
Con un mayor uso de terapias basadas en anticuerpos y agentes de contraste en la investigación y el manejo del cáncer, el método IVIL es altamente aplicable a la investigación y el desarrollo farmacéuticos. Los investigadores de terapias oncológicas, imágenes moleculares, inflamación y otras áreas pueden encontrar que el método IVIL proporciona información útil.
