Nuestro protocolo describe los nuevos hallazgos sobre la separación y purificación de moléculas activas de un extracto de planta. Los científicos pueden utilizar estos métodos para aislar moléculas pequeñas y péptidos de fuentes de productos naturales para los usuarios terapéuticos. Familiarícese con los componentes del instrumento y sus métodos de montaje.
Es importante estar seguro de que la muestra que se va a separar está preparada siguiendo las directrices sugeridas. Este método implica múltiples procesos de montaje del instrumento. Y la demostración visual ayudará a los usuarios a seguir y aplicarlos con éxito a la investigación.
Después de ensamblar la fase líquida, la unidad IEF como se describe en el manual de instrucciones, equilibre las membranas de intercambio de aniones con hidróxido de sodio molar 0.1 y las membranas de intercambio catiónico con ácido fosfórico molar 0.1. Alinee las juntas de goma para que los tres agujeros oblongos grandes permanezcan desbloqueados por el caucho. Esto ayudará a intercambiar los iones entre el electrodo y los compartimentos de la muestra a través de la membrana durante la electroforesis.
Montar la parte interior y externa del electrodo alineando los tres orificios oblongos en las juntas de intercambio iónico. A continuación, llene los electrodos con sus respectivos electrolitos para evitar que sus membranas se sequen. A continuación, apriete el soporte del tornillo de plástico para asegurar un montaje sin fugas.
Cubra las placas de recogida de muestras con cinta adhesiva. A continuación, ensamble las partes de la cámara de enfoque sobre el dedo de enfriamiento de cerámica en la siguiente secuencia: electrodo de ánodo, núcleo de membrana de nylon, cámara de enfoque y electrodo de cátodo. Con una jeringa de 50 mililitros, llene la cámara de enfoque con agua destilada preenfriada.
Para una celda IEF estándar, agregue 60 mililitros de agua. Conecte la unidad IEF al agua de refrigeración circulante a cuatro grados centígrados. Accione la unidad a 15 vatios y 3000 voltios hasta que la tensión se estabilice, aproximadamente de tres a cinco minutos.
A continuación, apague la fuente de alimentación. Con el colector de fracción, retire el agua de la celda. Vuelva a sellar las placas de recogida con cinta adhesiva.
Añadir 0,6 gramos de extracto de la planta de gimnasia, a 60 mililitros de agua destilada. Disuelva el extracto de la planta mezclando en un tubo de rodillo durante cinco minutos. Para eliminar las partículas insolubles, centrifuga esta solución a 10.000 veces G durante cinco minutos.
Transfiera el sobrenadante a un vaso de vidrio de 150 mililitros y agregue el anzuelo para crear una solución del 1% por volumen, aproximadamente 0,6 mililitros. Con una jeringa de 50 mililitros con una aguja de extremo romo de calibre 1,5 pulgadas y 19, cargue esta solución en la célula IEF a través de las placas de recogida de muestras. A continuación, retire la célula del soporte y toque la cámara del electrodo, para desalojar y eliminar cualquier burbuja.
Conecte la unidad al agua de refrigeración. Con la fuente de alimentación a 15 vatios constantes iniciar fraccionamiento. Ejecute la unidad IEF hasta que la tensión alcance un valor constante, aproximadamente tres horas.
Después de pulsar el botón harvest on align the fraction collector pins with the collection boards. Empuje los pasadores a través de la cinta de sellado para comenzar a recoger las fracciones de andaluza Gymnema. Cultivar una sola colonia de C.albicans y caldo de dextrosa de mezptona de levadura durante la noche a 30 grados centígrados con temblores.
Transfiera el cultivo a un tubo centrífugo y recoja las células de levadura por centrifugación a 10.000 veces G durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, suspenda las células de levadura en el tampón y gire la suspensión en un tubo de rodillos durante una hora a cinco grados centígrados. Para eliminar las células de levadura, centrifugar la suspensión a 10.000 veces G durante cinco minutos.
A continuación, filtre el extracto de proteína a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Transfiera el extracto de proteína a tubos de diálisis y dialízalo contra el agua durante 15 horas a cuatro grados centígrados. Después de estimar la concentración de proteínas, recoger un volumen de extracto de proteína que contiene 500 miligramos de proteína total.
Diluir los 500 miligramos de proteína en 60 mililitros de agua que contiene 1%ampholyte por volumen. Con una jeringa, cargue el extracto de proteína diluida en la célula IEF y opere la unidad a una temperatura constante de 15 vatios durante cuatro horas. Dado que este instrumento utiliza alimentación eléctrica de alta tensión, el usuario debe tomar todas las precauciones para evitar cualquier contacto directo con los electrodos en vivo.
El colector de fracción contiene 20 tubos de plástico, cada uno de 12 milímetros por 75 milímetros. Y está conectado a la bomba de vacío. Prepárese para recoger las fracciones pulsando el botón de cosecha.
A continuación, alinee los 20 pines de colección en el colector de fracción con la placa de recolección 20 para que la celda de enfoque sellada. Empuje los pasadores de recogida a través de la cinta de sellado y encienda simultáneamente la bomba de vacío. Cada tubo recogerá una fracción proteica de unos tres mililitros.
Después de reducir y hervir las fracciones proteicas, analízalas en un gel de página 12.5%SDS. Mancha el gel con tinte Coomassie Blue y colóquelo en un balancín a temperatura ambiente. Después de dos o tres horas, detenga el gel.
A continuación, grabe la imagen de gel con un imager de gel. Preparar una suspensión de células de levadura diluyendo un cultivo nocturno de C.albicans en una proporción de 1:1000 en el medio de cultivo celular RPMI complementado con 50 glucosa milimolar. Agregue 90 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de 96 pozos.
A continuación, agregue 10 microlitros de cada fracción G.sylvestre para separar los pozos. Como control negativo, agregue 10 microlitros de agua con un 1% de ampolla en pozos separados. Después de incubar la placa de 96 pozos a 37 grados Celsius durante 12 horas, observe la placa bajo un microscopio.
La falta de crecimiento filamentoso indica la inhibición de la conversión de C.albicans de levadura a hifa. Veinte fracciones de extracto de G.sylvestre se obtuvieron por fase líquida IEF. Las moléculas de color oscuro, los ácidos gimnómicos, migraron y se enriquecieron en el extremo del ánodo de la unidad.
En el extremo del cátodo se observaron fracciones translúcidas de color amarillo claro. Las alícuotas de cada refracción G.sylvestre se redujeron, herviron y resolvieron por la página SDS. Una mancha Coomassie Blue mostraba una banda de polipéptidos diferente a unos cinco kilodaltons, enriquecida en fracciones de 16 a 19.
Los ácidos gimnómicos en la fracción uno, y las siguientes fracciones no fueron detectados ya que no son proteicos. Sin embargo, estas moléculas pueden ser separadas por TLC y detectadas bajo la luz UV. La Fracción 10 no contenía una cantidad detectable de estas moléculas pequeñas, lo que sugiere que la mayoría de las moléculas pequeñas orgánicas se enriquecieron en las fracciones del uno al tres.
Las 20 fracciones de G.sylvestre fueron ensayadas para la inhibición de la conversión de levadura a hifa y el crecimiento de hipófas en C.albicans. La mayor inhibición se observó en la fracción uno y se observó poca o ninguna inhibición en las fracciones 10 y superiores. Las proteínas de la superficie celular de C.albicans fueron fraccionadas usando fase líquida IEF.
Y las alícuotas de 18 fracciones fueron analizadas por la página SDS. Las proteínas enriquecidas eran visibles en varias fracciones. El comienzo, moléculas pequeñas no podrían ser separados por enfoque isoeléctrico porque se cree que no son ambulatorias.
Nuestros estudios muestran que son ambulatorios, al menos semanales, y este método se puede explorar más a fondo para otras moléculas pequeñas.
