Notre protocole décrit les nouvelles découvertes sur la séparation et la purification des molécules actives à partir d’un extrait végétaux. Les scientifiques peuvent utiliser ces méthodes pour isoler les petites molécules et peptides des sources de produits naturels pour les utilisateurs thérapeutiques. Familiarisez-vous avec les composants de l’instrument et leurs méthodes d’assemblage.
Il est important de s’assurer que l’échantillon à séparer est préparé par les lignes directrices proposées. Cette méthode implique plusieurs processus d’assemblage de l’instrument. Et la démonstration visuelle aidera les utilisateurs à les suivre et à les appliquer avec succès à la recherche.
Après l’assemblage de la phase liquide, unité IEF tel que décrit dans le manuel d’instruction, équilibrer les membranes d’échange d’anion avec 0,1 hydroxyde de sodium molaire et les membranes d’échange de cation avec 0,1 acide phosphorique molaire. Alignez les joints en caoutchouc de sorte que les trois grands trous oblongs restent débloqués par le caoutchouc. Cela permettra d’échanger les ions entre l’électrode et les compartiments de l’échantillon via la membrane pendant l’électrophorèse.
Assembler la partie intérieure et extérieure de l’électrode en alignant les trois trous oblongues dans les joints d’échange d’ion. Remplissez ensuite les électrodes de leurs électrolytes respectifs pour éviter que leurs membranes ne se dessèchent. Ensuite, serrez le porte-vis en plastique pour assurer un assemblage sans fuite.
Couvrir les panneaux de collecte d’échantillons de ruban adhésif. Assemblez ensuite les parties de la chambre de focalisation sur le doigt de refroidissement en céramique dans la séquence suivante : électrode d’anode, noyau de membrane de nylon, chambre de focalisation et électrode cathodique. À l’aide d’une seringue de 50 millilitres, remplir la chambre de mise au point d’eau distillée pré-refroidie.
Pour une cellule IEF standard, ajouter 60 millilitres d’eau. Connectez l’unité IEF à l’eau de refroidissement circulante à quatre degrés Celsius. Actionner l’appareil à 15 watts et 3000 volts jusqu’à ce que la tension se stabilise, environ trois à cinq minutes.
Ensuite, éteignez la source d’énergie. À l’aide du collecteur de fractions, retirer l’eau de la cellule. Resceller les planches de collecte avec du ruban adhésif.
Ajouter 0,6 gramme d’extrait de plante Gymnema sylvestre à 60 millilitres d’eau distillée. Dissoudre l’extrait de la plante en mélangeant dans un tube à rouleaux pendant cinq minutes. Pour enlever les particules insolubles, centrifugez cette solution à 10 000 fois G pendant cinq minutes.
Transférer le supernatant dans un bécher en verre de 150 millilitres et ajouter de l’ampholyte pour créer une solution de 1 % en volume, soit environ 0,6 millilitres. À l’aide d’une seringue de 50 millilitres avec une aiguille à extrémité émoussée de calibre 1,5 po 19, chargez cette solution dans la cellule IEF à travers les panneaux de collecte de l’échantillon. Retirez ensuite la cellule du support et appuyez sur la chambre d’électrode, pour déloger et enlever les bulles.
Connectez l’appareil à l’eau de refroidissement. Avec l’alimentation électrique à constante 15 Watts commencer la fractionnement. Exécutez l’unité IEF jusqu’à ce que la tension atteigne une valeur constante, environ trois heures.
Après avoir appuyé sur la récolte sur le bouton aligner les broches collecteur fraction avec les tableaux de collecte. Poussez les broches à travers le ruban d’étanchéité pour commencer à recueillir les fractions Gymnema sylvestre. Cultiver une seule colonie de C.albicans et de levure pepitone bouillon dextrose nuit à 30 degrés Celsius avec des secousses.
Transférer la culture dans un tube de centrifugeuse et recueillir les cellules de levure par centrifugation à 10 000 fois G pendant cinq minutes. Après avoir enlevé le supernatant, suspendre les cellules de levure en tampon et faire pivoter la suspension dans un tube à rouleaux pendant une heure à cinq degrés Celsius. Pour enlever les cellules de levure, centrifugez la suspension à 10 000 fois G pendant cinq minutes.
Filtrez ensuite l’extrait protéique à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre. Transférer l’extrait de protéines dans un tube de dialyse et dialyser contre de l’eau pendant 15 heures à quatre degrés Celsius. Après avoir estimé la concentration en protéines, recueillir un volume d’extrait de protéines contenant 500 milligrammes de protéines totales.
Diluer les 500 milligrammes de protéines dans 60 millilitres d’eau contenant 1% d’ampholyte en volume. À l’aide d’une seringue, charger l’extrait de protéines diluées dans la cellule IEF et faire fonctionner l’appareil à une constante de 15 Watts pendant quatre heures. Puisque cet instrument utilise l’alimentation électrique à haute tension, l’utilisateur doit prendre toutes les précautions pour éviter tout contact direct avec les électrodes vivantes.
Le collecteur de fractions contient 20 tubes en plastique, chacun de 12 millimètres par 75 millimètres. Et il est connecté à la pompe à vide. Préparez-vous à recueillir les fractions en appuyant sur la récolte sur le bouton.
Alignez ensuite les 20 broches de collection sur le collecteur de fractions avec le tableau de collecte 20 de sorte que la cellule de mise au point scellée. Poussez les broches de collecte à travers le ruban d’étanchéité et allumez simultanément la pompe à vide. Chaque tube recueillera une fraction protéique d’environ trois millilitres.
Après avoir réduit et bouilli les fractions de protéines, analysez-les sur un gel de page SDS de 12,5 %. Tachez le gel avec du colorant Coomassie Blue et placez-le sur un rocker à température ambiante. Après deux à trois heures de destain le gel.
Enregistrez ensuite l’image gel à l’aide d’un imageur de gel. Préparer une suspension cellulaire de levure en diluant une culture nocturne de C.albicans à un rapport de 1:1000 dans le milieu de culture cellulaire RPMI complété par 50 millimolaire de glucose. Ajouter 90 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de puits de 96 puits.
Ensuite, ajoutez 10 microlitres de chaque fraction G.sylvestre pour séparer les puits. En tant que contrôle négatif, ajouter 10 microlitres d’eau avec 1% d’ampholyte dans des puits séparés. Après avoir couver la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant 12 heures, observez la plaque au microscope.
L’absence de croissance filamenteuse indique l’inhibition de la conversion de levure-hypha de C.albicans. Vingt fractions d’extrait de G.sylvestre ont été obtenues par phase liquide IEF. Les molécules de couleur foncée, les acides gymnémiques, ont migré vers et ont été enrichis à l’extrémité anode de l’unité.
Des fractions jaune clair translucides ont été observées à l’extrémité cathodique. Les aliquots de chaque réfraction de G.sylvestre ont été réduits, bouillis et résolus par la page SDS. Une tache bleue de Coomassie a montré une bande différente de polypeptide à environ cinq kilodaltons, enrichie en fractions 16 à 19.
Les acides gymnémiques dans la fraction un, et les fractions suivantes n’ont pas été détectées puisqu’ils ne sont pas protéinés. Cependant, ces molécules peuvent être séparées par TLC et détectées sous la lumière UV. Fraction 10 ne contenait pas une quantité détectable de ces petites molécules suggérant que la plupart des petites molécules organiques ont été enrichies en fractions une à trois.
Les 20 fractions de G.sylvestre ont été apaises pour l’inhibition de la conversion de levure-à-hypha et la croissance hyphal dans C.albicans. La plus grande inhibition a été observée dans la fraction un et peu ou pas d’inhibition a été observée dans les fractions 10 et au-dessus. Les protéines de surface cellulaires des C.albicans ont été fractionnées à l’aide de l’IEF de phase liquide.
Et les aliquots de 18 fractions ont été analysés par la page SDS. Les protéines enrichies étaient visibles en plusieurs fractions. Au début, les petites molécules ne pouvaient pas être séparées par la focalisation isoélectrique parce qu’on croit qu’elles ne sont pas ambulatoires.
Nos études montrent qu’ils sont ambulatoires, au moins chaque semaine, et cette méthode peut être explorée plus avant pour d’autres petites molécules.
