Nosso protocolo descreve as novas descobertas sobre a separação e purificação de moléculas ativas de um extrato vegetal. Os cientistas podem usar esses métodos para isolar pequenas moléculas e peptídeos de fontes de produtos naturais para usuários terapêuticos. Familiarize-se com os componentes do instrumento e seus métodos de montagem.
É importante ter certeza de que a amostra a ser separada é preparada pelas diretrizes sugeridas. Este método envolve múltiplos processos de montagem do instrumento. E a demonstração visual ajudará os usuários a segui-los e aplicá-los com sucesso na pesquisa.
Após a montagem da fase líquida, a unidade IEF, conforme descrito no manual de instruções, equilibra as membranas de troca de ânion com hidróxido de sódio molar 0,1 e as membranas de troca de cáção com ácido fosfórico molar 0,1. Alinhe as juntas de borracha para que os três grandes orifícios oblongos permaneçam desbloqueados pela borracha. Isso ajudará a trocar os íons entre o eletrodo e os compartimentos amostrais através da membrana durante a eletroforese.
Monte a porção interna e externa do eletrodo alinhando os três orifícios oblongos nas juntas de troca de íons. Em seguida, encha os eletrodos com seus respectivos eletrólitos para evitar que suas membranas sequem. Em seguida, aperte o suporte do parafuso plástico para garantir um conjunto livre de vazamentos.
Cubra as placas de coleta de amostras com fita de vedação. Em seguida, monte as partes da câmara de foco sobre o dedo de resfriamento cerâmico na seguinte sequência: eletrodo de ânodo, núcleo de membrana de nylon, câmara focal e eletrodo de cátodo. Usando uma seringa de 50 mililitros, encha a câmara de foco com água destilada pré-resfriada.
Para uma célula IEF padrão, adicione 60 mililitros de água. Conecte a unidade IEF à água de resfriamento circulante a quatro graus Celsius. Opere a unidade a 15 watts e 3000 volts até que a tensão se estabilize, aproximadamente três a cinco minutos.
Em seguida, desligue a fonte de energia. Usando o coletor de frações, remova a água da célula. Selar as placas de coleta com fita adesiva.
Adicione 0,6 gramas de extrato vegetal gymnema sylvestre, a 60 mililitros de água destilada. Dissolva o extrato da planta misturando-se em um tubo de rolo por cinco minutos. Para remover as partículas insolúveis, centrifugar esta solução a 10.000 vezes G durante cinco minutos.
Transfira o supernatante para um copo de vidro de 150 mililitros e adicione ampholyto para criar uma solução de 1% em volume, aproximadamente 0,6 mililitros. Usando uma seringa de 50 mililitros com uma agulha final de 1,5 polegadas de calibre 19, carregue esta solução na célula IEF através das placas de coleta de amostras. Em seguida, remova a célula do suporte e toque na câmara de eletrodos, para desalojar e remover quaisquer bolhas.
Conecte a unidade à água de resfriamento. Com a fonte de alimentação para 15 Watts constantes começam o fracionamento. Execute a unidade IEF até que a tensão atinja um valor constante, aproximadamente três horas.
Depois de pressionar a colheita no botão, alinhe os pinos coletores de fração com as placas de coleta. Empurre os pinos através da fita de vedação para começar a coletar as frações de gymnema sylvestre. Cresça uma única colônia de c.albicans e levedura pepitone dextrose caldo durante a noite a 30 graus Celsius com agitação.
Transfira a cultura para um tubo de centrífuga e colete as células de levedura por centrifugação a 10.000 vezes G durante cinco minutos. Depois de remover o supernascimento, suspenda as células de levedura no buffer e gire a suspensão em um tubo de rolo por uma hora a cinco graus Celsius. Para remover as células de levedura, centrifugar a suspensão a 10.000 vezes G durante cinco minutos.
Em seguida, filtrar o extrato de proteína através de um filtro de 0,45 micrômetros. Transfira o extrato de proteína para tubos de diálise e diálise contra água por 15 horas a quatro graus Celsius. Após estimar a concentração proteica, colete um volume de extrato de proteína contendo 500 miligramas de proteína total.
Diluir os 500 miligramas de proteína em 60 mililitros de água contendo 1% de amfolito em volume. Usando uma seringa, carregue o extrato de proteína diluída na célula IEF e opere a unidade a uma constante de 15 Watts por quatro horas. Uma vez que este instrumento utiliza fornecimento elétrico de alta tensão, o usuário deve tomar todas as precauções para evitar qualquer contato direto com os eletrodos vivos.
O coletor de frações contém 20 tubos plásticos, cada um 12 milímetros por 75 milímetros. E está ligado à bomba de vácuo. Prepare-se para coletar as frações pressionando a colheita no botão.
Em seguida, alinhe os 20 pinos de coleta no coletor de frações com a placa de coleta de 20 para que a célula de foco lacrada. Empurre os pinos de coleta através da fita de vedação e, simultaneamente, ligue a bomba de vácuo. Cada tubo coletará uma fração de proteína de cerca de três mililitros.
Depois de reduzir e ferver as frações proteicas, analise-as em um gel de página SDS de 12,5%. Manche o gel com corante Azul Coomassie e coloque-o em um roqueiro à temperatura ambiente. Depois de duas a três horas desendo o gel.
Em seguida, grave a imagem em gel usando um imager de gel. Prepare uma suspensão celular de levedura diluindo uma cultura noturna de C.albicans a uma proporção de 1:1000 em meio de cultura celular RPMI suplementado com 50 milialares de glicose. Adicione 90 microliters da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços.
Em seguida, adicione 10 microliters de cada fração G.sylvestre para separar poços. Como controle negativo, adicione 10 microliters de água com 1% de amfolito em poços separados. Depois de incubar a placa de 96 poços a 37 graus Celsius durante 12 horas, observe a placa sob um microscópio.
A falta de crescimento filamentoso indica a inibição da conversão de leveduras c.albicans para hifa. Vinte frações de extrato de G.sylvestre foram obtidas por IEF de fase líquida. Moléculas de cor escura, os ácidos gymnémicos, migraram para e foram enriquecidos no final do ânodo da unidade.
Frações amarelas claras translúcidas foram observadas na extremidade do cátodo. As alíquotas de cada refração g.sylvestre foram reduzidas, fervidas e resolvidas pela página SDS. Uma mancha de Coomassie Blue mostrou uma banda de polipeptídeo diferente em cerca de cinco kilodaltons, enriquecido em frações 16 a 19.
Os ácidos gymnémicos na fração um, e as frações seguintes não foram detectadas, pois não são proteináceos. No entanto, essas moléculas podem ser separadas por TLC e detectadas sob luz UV. A fração 10 não continha uma quantidade detectável dessas pequenas moléculas sugerindo que a maioria das pequenas moléculas orgânicas foram enriquecidas em frações de um a três.
Todas as 20 frações de G.sylvestre foram avaliadas para inibição da conversão de leveduras para hipha e crescimento hifálfa em C.albicans. A maior inibição foi observada na fração um e pouca ou nenhuma inibição foi observada em frações 10 ou superiores. Proteínas de superfície celular de C.albicans foram fracionadas usando IEF de fase líquida.
E as alíquotas de 18 frações foram analisadas pela página da SDS. Proteínas enriquecidas eram visíveis em várias frações. No início, pequenas moléculas não poderiam ser separadas pelo foco isoelétrico porque acredita-se que não sejam ambulatoriais.
Nossos estudos mostram que eles são ambulatoriais, pelo menos semanalmente, e este método pode ser explorado ainda mais para outras pequenas moléculas.
