Este trabajo está financiado por el proyecto de la UE PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) y el Ministerio holandés de Salud, Bienestar y Deporte (proyecto V/050012). Nos gustaría agradecer a la Dra. Yvonne Staal y al Dr. Jan van Benthem por revisar críticamente el manuscrito.

1. Preparación del medio de cultivo celular (CCM)
<ol><li>Preparar una botella de 500 ml de medio esencial mínimo (MEM) complementado con glutamina.</li>
	<li>Añadir 5 ml de penicilina-estreptomicina (es decir, 100 penicilinas U/mL y 100 μg/mL de estreptomicina).</li>
	<li>Añadir 5 ml de solución de aminoácidos no esenciales (NEAA).</li>
	<li>Añadir 10 ml de anfotericina B (opcional).</li>
	<li>Añadir 50 ml de FBS (inactivado por calor, por favor siga el protocolo ATCC para la inactivación de calor; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, página 19)).</li>
</ol>2. Subculturing de células Calu-3
NOTA: Las células Calu-3 se cultivan en frascos de cultivo celular T75 o T175 a 37 °C y 5% CO2. Las celdas se pasan al 60-80% de confluencia cada 7 días con renovación de CCM cada 2-3 días. Ccm se vierte y ccm fresco (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL, y T175 = 25 mL) se canaliza en el matraz y el matraz se coloca de nuevo en la incubadora. Las células deben ser pasadas por lo menos 2 veces después de descongelarse, antes de usarlas en experimentos, o antes de congelarse, y no deben pasar más de 25 veces en total.
<ol><li>Confirme si el matraz es 60-80% confluente comprobando bajo un microscopio de luz.</li>
	<li>Vierta el CCM del matraz.</li>
	<li>Lave las células 2 veces con 5 ml de solución de sal equilibrada (HBSS) de 1x Hanks sin calcio y sin magnesio. Deseche el HBSS después de cada lavado. HBSS elimina el suero, que inhibe la trippsina.</li>
	<li>Añadir 3 ml de trypsin-EDTA para un T75 (4 ml para un T175) y colocar el matraz de nuevo en la incubadora a 37 °C y 5% CO2 durante 10-15 min. Compruebe después de 10 min, asegurando que las células se hayan desprendido de la superficie del matraz. En caso de que las células crezcan a >80% de confluencia, no se separarán usando trypsin 0.05% y trypsin 0.25% podría ser utilizado.</li>
	<li>Añadir 6 mL (es decir, duplicar el volumen trypsin-EDTA originalmente añadido) de CCM al matraz y agitar suavemente los frascos para asegurar una mezcla adecuada. Esto es para asegurar que la trypsin ha sido neutralizada por el FBS en el CCM y su actividad en las células detenidas. Si se permite que la trippsina permanezca en contacto con las células durante demasiado tiempo, no volverán a colocarse cuando se pongan en un nuevo matraz de cultivo celular.</li>
	<li>Vierta el contenido completo del matraz en un tubo centrífuga de 50 ml.</li>
	<li>Centrífuga las células durante 5 min a 130 x g,asegurándose de que la centrífuga esté correctamente equilibrada.</li>
	<li>Vuelva a colocar el vial que contiene las células en condiciones asépticas y retire el sobrenadante suavemente, sin alterar el pellet. El sobrenadante se puede verter y el resto pipetted apagado, asegurando que el pellet no se perturba.</li>
	<li>Resuspend el pellet celular en 1 ml de CCM pipendo hacia arriba y hacia abajo hasta que se suspendan todas las células (es decir, no se observan aglomerados de pellets o células). Se puede agregar CCM adicional para diluir la suspensión celular.</li>
	<li>Cuente las células, tanto muertas como vivas, en 1 ml de CCM usando un hemocítómetro. Si es necesario para un recuento adecuado, diluya las células en 3 o 4 ml.</li>
	<li>Suspenda las celdas en el volumen CCM requerido y agregue la suspensión de la celda en cada matraz. Para lograr alrededor del 80% de confluencia en una semana, sembrar 2 x 106 células en un T75 o 6 x 106 células en un T175.</li>
	<li>Mezcle suavemente el matraz y vuelva a colocarlo en la incubadora a 37 °C y 5% CO2.</li>
	<li>Reemplace con CCM fresco cada 2–3 días y subcultura cuando las células alcancen el 60-80% de confluencia.</li>
</ol>3. Sembrar células Calu-3 en inserciones de cultivo
NOTA: Las plaquitas están disponibles con diferentes tamaños de poros. Los tamaños de poros pequeños (por ejemplo, 0,4 μm) tienen la ventaja de que las células crecen más fácilmente y pueden lograr una buena barrera ya después de 5 días de cultivo en condiciones sumergidas, medida por resistencia eléctrica epitelial trans (TEER). Sin embargo, cuando están interesados en la translocación de partículas, estos poros son demasiado pequeños y atraparán las partículas. Por lo tanto, los tamaños de poros más grandes (por ejemplo, 3 μm) generalmente se eligen para probar partículas. Cuando se utiliza un tamaño de poro más grande, las células necesitan períodos de tiempo más largos (por ejemplo, 7-10 días de cultivo en condiciones sumergidas) para lograr un buen TEER.
<ol><li>Prepare la suspensión celular con concentración conocida siguiendo los pasos 2.1–2.10.</li>
	<li>Diluir las células a una concentración de 5 x 105 células/ml en CCM preguerrado para 6 plaquitas de pozo o 2,5 x 105 celdas/ml para 12 plaquitas de pozo.</li>
	<li>Tome una placa de cultivo celular con plaquitas y colóquela en condiciones asépticas.</li>
	<li>Llene el lado basolateral con 2 ml de CCM prewarmed para 6 plaquitas de pozo, o 1 mL para 12 plaquitas de pozo. Al agregar el medio de cultivo, saque la plaquita con pinzas.</li>
	<li>Mezcle cuidadosamente la suspensión de la celda canalizando hacia arriba y hacia abajo. Pipeta 1,0 ml para 6 plaquitas de pozo y 500 μL para 12 plaquitas de pozos (equivalentes a 100.000 células/cm2)en la parte superior de la membrana en el inserto de cultivo celular con 0,4 μm de poros. Para los poros de 3,0 μm, aumente la densidad celular a 128.000 células/cm2.</li>
	<li>Cubra la placa de cultivo celular e incubar a 37 °C y 5% CO2.</li>
	<li>Cambie el MCP cada 2–3 días.</li>
	<li>Deje que las células se vuelvan confluentes durante 7 días en condiciones sumergidas antes de continuar cultivando en el ALI.</li>
	<li>Medir TEER.<ol>
<li>Tome un voltohmómetro epitelial complementado con conjunto de electrodos de palillo y cargue el sistema de baterías durante la noche.</li>
		<li>Desconecte el Voltohmmeter del cargador y conecte el electrodo del palillo.</li>
		<li>Limpie el electrodo con un 70% de etanol.</li>
		<li>Coloque el electrodo en el CCM colocando el electrodo más largo en el medio de cultivo externo hasta que toque la parte inferior del plato y poniendo el electrodo más corto en el medio sin tocar la membrana.</li>
		<li>Comience con una plaquita vacía sin celdas. Espere hasta que la medición se estabilice y anote la resistencia en Ohmios. Esta medida es la resistencia de la membrana de la plaquita sin ninguna celda (es decir, resistencia en blanco).</li>
		<li>Repita la medición de cada plaquita y reste la resistencia en blanco para obtener la verdadera resistencia.</li>
		<li>Para el análisis de datos, multiplique los valores de resistencia por el área de superficie de la plaquita en Ω x cm2. Para una inserción de 6 pozos, la superficie es de 4,67 cm2. Por lo tanto, si se mide una resistencia de 600 Ohmios y el fondo es de 120 Ohmios, la resistencia es de 480 Ohmios, que luego se multiplica por la superficie de 4,67 cm2 para un total de 2.241,6 Ohmios x cm2. El TEER debe ser >1.000 Ω x cm2 para continuar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire el CCM del lado apical de las plaquitas.</li>
	<li>Añadir 2 ml de CCM prewarmed para 6 pozos y 1 mL para 12 plaquitas de pozo al lado basolateral del pozo (es decir, debajo de la inserción de cultivo celular). El CCM debe tocar la membrana desde la parte inferior, pero no filtrarse en la parte superior de la plaquita.</li>
	<li>En este punto las células están expuestas apáticamente al aire, que se conoce como cultivo en el ALI.</li>
	<li>Células de cultivo en el ALI en la incubadora a 37 °C y 5% CO2 durante 7 días antes de la exposición.</li>
	<li>Cambie el CCM basolateral cada 2-3 días. Las células se pueden utilizar en el ALI durante 6 semanas.</li>
</ol>4. Preparación de la configuración de exposición
NOTA: Las secciones 5–7 describen los preparativos para la exposición a partículas utilizando una estación de exposición automatizada (AES, ver Tabla de Materiales). La configuración para la nebulización y caracterización de partículas también es compatible con otros sistemas de exposición ALI de otros fabricantes. Como ejemplo, la exposición a partículas se describe a continuación. Estos sistemas también se pueden utilizar para otras exposiciones, como sensibilizantes, humo de cigarrillos y escape diésel. La Figura 1 muestra el AES y un módulo de exposición. La Figura 2 muestra una representación esquemática de la configuración de exposición, incluidos todos los demás instrumentos.
<ol><li>Antes de iniciar una exposición utilizando el AES, conecte el sistema a varios instrumentos para medir las características del aerosol; estos se miden en una corriente lateral justo antes de que los aerosoles entren en el armario. NOTA: Se utiliza un divisor de flujo para conectar la corriente lateral al equipo de caracterización de exposición. Generalmente, se utiliza el siguiente equipo: tamaño de partícula de movilidad de barrido (SMPS), dimensionador óptico de partículas (OPS), contador de partículas de condensación (CPC), microequilibrio oscilante de elementos cónicos (TEOM). Las mediciones SMPS y OPS se realizan 1x por hora y utilizan el mismo tubo desde el divisor de flujo. El CPC y el TEOM realizan medición continua y los datos de ambos se registran en un registrador de datos Squirrel modelo 2020. Además, la concentración de masa gravimétrica se determina utilizando un microequilibrio en humedad relativa controlada (40-70 %) y condiciones de temperatura (21–23 °C). Los filtros de teflón se pesan antes y después de cada exposición para confirmar la concentración de exposición. Para capturar el escape, se utiliza un filtro HEPA. La configuración, incluidas las suspensiones de nanomateriales de ingeniería (ENM) y el nebulizador, se colocan en un gabinete de flujo para evitar cualquier exposición a las personas. El AES se puede utilizar para probar muchos tipos diferentes de ENM, incluyendo metales y óxidos metálicos.</li>
	<li>Prepare una suspensión nanomaterial poco antes de la exposición. Por lo general, se prepara una suspensión del 1% como solución de stock. Por ejemplo, suspender 100 mg de nanomaterial en 10 ml de agua pura. NOTA: Para la exposición DQ12, se utilizan 300 mg para alcanzar aproximadamente 2 μg/cm2. Esta cantidad se puede utilizar en una sola exposición o dividirse sobre exposiciones repetidas (por ejemplo, 300 mg se suspende en 30 ml para una sola exposición o 21,5 mg se suspende en 2,15 ml frescos todos los días durante 3 semanas de exposición repetida). La suspensión se prepara recién en cada día de exposición. La suspensión de partículas se sonica durante 16 min utilizando sonicación de sonda. El volumen de la solución de stock del 1% se ajusta a un volumen total de 100 ml mediante la adición de agua pura.</li>
	<li>Coloque la suspensión ENM en una botella pequeña con una tapa y un agitador magnético para evitar el sedimento de las partículas. Conecte la botella a una bomba peristáltica a través de un tubo pequeño y ajuste el flujo a 25 mL/h.</li>
	<li>Conecte la bomba peristáltica a una boquilla de pulverización y ajuste los ajustes para permitir la en aerosolización continua.</li>
	<li>La boquilla de pulverización está montada en un tubo de aluminio de 60 cm de largo (cámara de mezcla, diámetro 15 cm, calentado a 60 °C). La configuración está conectada al AES a través de un tubo de cobre de 1,5 metros de largo (diámetro 15 cm). Además del AES, un impactador elimina todos los aerosoles de más de 2,5 μm.</li>
	<li>Conecte la boquilla de pulverización a aire comprimido de 3 barras a través de dos controladores de flujo de masa (MFC) para permitir la nebulización de las suspensiones. Un flujo de 14 L/min se utiliza para la boquilla de pulverización, el otro MFC para la mezcla del aire en el tubo.</li>
	<li>El día antes del inicio de la exposición, encienda el AES para permitir que el gabinete alcance una temperatura de 37 °C.</li>
	<li>Encienda el flujo de aire y la humedad en el armario 2 h antes del inicio de la exposición, para alcanzar el 85% de humedad. Encienda el calentamiento de las cámaras de exposición en las que se colocarán las plaquitas con las celdas.</li>
	<li>Encienda el microequilibrio de cuarzo (QCM) y establezca el valor inicial en 0 utilizando el software. Comience a registrar. Cada 10 s la masa se mide y se expresa como ng/cm2.</li>
	<li>Caliente los medios de cultivo celular a 37 °C en un baño de agua (~20–30 min).</li>
</ol>5. Preparación de células Calu-3 para la exposición
NOTA: Para una exposición ali típica usando el AES, se necesitan 15-20 plaquitas con una capa celular confluente. Consisten en 3 controles de aire limpio, 3 controles de incubadora que se manejarán de forma similar a las otras plaquitas sin exposición en el AES, 6-8 plaquitas para la exposición al aerosol (dependiendo del uso de 0, 1 o 2 microequilibrios), 1-3 plaquitas para mediciones de control (como la liberación máxima de LDH) y 3 plaquitas de repuesto en caso de que el TEER de algunas de las plaquitas no sea suficiente. Las celdas deben tener un TEER de >1.000 Ω x cm2 para continuar.
<ol><li>En el primer día de exposición, lave las células 1x con CCM, compruebe la morfología celular y mida el TEER del modelo celular usando un Voltohmmeter. Las células deben formar una monocapa apretada sin huecos.</li>
	<li>Ponga 2 mL/1 mL de HEPES en búfer CCM sin FCS al lado basolateral de 6 placas de pozo/12 y transfiera las plaquitas de cultivo con celdas a las nuevas placas. NOTA: Durante la exposición, no hay CO2 presente en el AES. Por lo tanto, el medio de cultivo almacenado en búfer HEPES (HEPES de 25 mM) se utiliza durante el transporte y la exposición. Este medio se utiliza tanto para las células expuestas en el AES como para las células de control de incubadoras.</li>
	<li>En caso de que el tiempo para transportar los cultivos celulares al AES sea superior a 5 min, coloque las celdas en una incubadora portátil de 37 °C durante el transporte.</li>
</ol>6. Manipulación del AES durante una exposición
<ol><li>En el AES, llene los módulos de exposición con CCM amortiguado por HEPES sin suero de becerro fetal (FCS). La cantidad de MCP depende de la unidad utilizada y del tipo de inserción de cultivo de celda. Tenga en cuenta que para mantener las células en el ALI, el medio debe llegar a la parte inferior de la membrana, pero no debe filtrarse en la parte superior de la membrana. Cuando utilice 6 plaquitas de pozo, agregue 6 ml de CCM amortiguado por HEPES a los módulos de exposición.</li>
	<li>Transfiera las plaquitas con células de las placas a los módulos de exposición utilizando pinzas estériles. Compruebe que no haya burbujas de aire en el lado basolateral de las celdas y retire cualquier CCM en el lado apical de las plaquitas. En caso de que haya algunas burbujas de aire en el lado basolateral, gire suavemente las plaquitas usando las pinzas estériles hasta que se retiren. Mantenga las placas que contienen CCM en una incubadora para su transferencia después de una exposición.</li>
	<li>Utilice la pantalla táctil para elegir la duración de la exposición, el caudal de aire y la mejora de la deposición electrostática. La pantalla también se puede utilizar para comprobar la humedad y la temperatura. Por lo general, se elige una duración de exposición de 4 h, con un caudal de 50 ml/min en las plaquitas a 37 °C y un 85% de humedad. NOTA: Los módulos del primer nivel (Figura 1) se utilizan para la exposición al aire limpio; las plaquitas de este nivel se utilizan como controles de exposición al aire limpio. Los demás módulos del segundo y tercer nivel se pueden utilizar para la exposición al aerosol, incluidos dos módulos para microequilibrios de cristal de cuarzo (QCM) para medir la deposición en línea.</li>
	<li>La prueba de fugas debe realizarse antes de iniciar la exposición. La fuga debe ser inferior a 5 ml/min. Siga las instrucciones que aparecen en la pantalla de AES. Una vez finalizada la prueba de fugas, se puede iniciar la exposición. En caso de fuga, se debe comprobar el tubo.</li>
	<li>Al final de la exposición, abra la puerta de un módulo AES, abra los módulos de exposición, coloque las plaquitas de cultivo celular de nuevo a las placas de cultivo celular y transfiera las placas a la incubadora portátil.</li>
	<li>Recoja los medios de los módulos (es decir, muestras expuestas) y de las placas (es decir, controles de incubadora) para su posterior análisis, como la medición de lactato deshidrogenasa (LDH).</li>
	<li>De vuelta en el laboratorio de cultivo celular, transfiera las plaquitas de cultivo celular a placas llenas de CCM estándar fresco. Coloque las placas de cultivo celular en la incubadora hasta la siguiente exposición o hasta su análisis.</li>
	<li>Después del día de exposición final, coloque las plaquitas en la incubadora hasta el día siguiente.</li>
	<li>Al día siguiente de la exposición final, agregue CCM al lado apical para medir EL TEER usando un Voltohmmeter. Recoja el CCM basolateral y apical por separado para el análisis de citoquinas.</li>
	<li>Retire todo ccm y realice un ensayo de viabilidad celular agregando, por ejemplo, un reactivo de proliferación al lado apical.</li>
</ol>7. Limpieza del AES
<ol><li>Llene los módulos de exposición con agua, espere 1 minuto y retire el agua. A continuación, llene los módulos con un 70% de etanol, déjelo durante 10 minutos y retire el etanol. Limpie las trompetas de exposición también con un 70% de etanol.</li>
	<li>Detenga el control de humedad del 85%, pero deje la temperatura del gabinete a 37 °C para el próximo experimento.</li>
</ol>

<ol>
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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-day+inhalation+toxicity+study+of+three+types+of+synthetic+amorphous+silicas+in+Wistar+rats+and+post-exposure+evaluations+for+up+to+3+months.">Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months.</a> Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).</li><li>Cho, W. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+toxicity+determination+by+in+vitro+exposure+at+the+air+liquid+interface+with+an+integrated+online+dose+measurement.">Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement.</a> Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).</li><li>van Ravenzwaay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+fate+and+effects+of+three+particles+of+different+surface+properties:+nano-TiO(2),+pigmentary+TiO(2)+and+quartz.">Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz.</a> Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).</li><li>Henderson, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+inflammatory+response+of+the+lung+to+inhaled+versus+instilled+particles+in+F344+rats.">A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats.</a> Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este artículo describe un método para cultivar células epiteliales bronquiales humanas bajo ALI y exponer este modelo bronquial a aerosoles o gases. La ventaja de usar células Calu-3 es que forman uniones estrechas, siguen siendo una monocapa, son capaces de soportar el flujo de aire y se pueden cultivar durante semanas en el ALI, a diferencia de muchos otros tipos de células (por ejemplo, 16HBE, H292 y BEAS-2B). El uso de la estación de exposición automatizada (AES) vitrocell® tiene la ventaja de que las células pueden ser expuestas en condiciones realistas y relevantes, ya que se pueden aplicar bajas concentraciones utilizando un flujo de aire continuo.
Los sistemas de flujo continuo, como el AES, tienen ventajas en comparación con el uso de sistemas en la nube3,32, que utilizan una sola nebulización de una suspensión. El flujo continuo es más realista y muchas variables como el caudal, la humedad y la temperatura se controlan. Además, la deposición se puede mejorar utilizando un campo eléctrico. Por último, las características del aerosol como el tamaño, la concentración numérica y la masa se supervisan en línea. Una desventaja es que los sistemas de flujo continuos son más complejos en comparación con los sistemas en la nube. Por lo tanto, es importante llevar a cabo experimentos preparatorios que se centren en las características de las partículas del aerosol y la dosis administrada en la plaquita. La concentración inicial inicial de las partículas y los ajustes de AES se pueden ajustar para lograr la dosis deseada en las células33. Dependiendo del tipo de partículas que se prueben, el método de generación de aerosoles puede diferir. El uso de la deposición electrostática depende del tipo de partícula y funciona mejor para partículas metálicas. Para las partículas con una carga superficial positiva, se debe aplicar un campo electrostático negativo y viceversa.
La selección de las concentraciones de exposición puede ser difícil para cualquier experimento de exposición aire-líquido. Para las exposiciones DQ12, el objetivo era lograr una dosis acumulada total de 1 μg/cm2 después de 3 semanas de exposición, 5 días a la semana, 4 h por día. Esta dosis es similar a las dosis que indujeron un efecto in vivo21,25,27,32,33. Al realizar las exposiciones, hubo alguna variación entre los diferentes días de exposición. Aunque la dosis real depositada de 1,6 μg/cm2 es superior a la 1 μg/cm2 destinada, la dosis podría haber sido demasiado baja para observar los efectos en el modelo Calu-3. Sólo se observaron diferencias menores en el TEER, la viabilidad y la respuesta a las citoquinas entre la exposición al aire limpio y la exposición al DQ12, y estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Una explicación para la observación de que la exposición DQ12 durante 3 semanas no indujo efectos significativos en las células Calu-3 es que faltaban macrófagos del modelo Calu-3. Posiblemente, después de la absorción de DQ12 macrófagos producen citoquinas proinflamatorias que pueden afectar a las células calu-3. Otra explicación es que el lote DQ12 que se utilizó para los experimentos no fue tan reactivo como se esperaba. Cuando se utiliza LPS como sustancia de control positiva, Calu-3 muestra una respuesta, medida por un aumento en la liberación de LDH y un aumento en la liberación de TNF-α. Esto indica que el modelo puede detectar toxicidad.
El modelo de celda Calu-3 tiene muchas ventajas, como se describe en la sección de resultados. Además, cuando se cultiva durante más tiempo en el ALI, las células Calu-3 pueden cultivar estructuras cilia/cilia-like13 y producir moco11,12,13. A pesar de estas ventajas, el modelo tiene limitaciones con respecto a su relevancia fisiológica. Las líneas celulares Calu-3 se originan a partir de un adenocarcinoma, mientras que 16HBE y BEAS-2B se originan en tejido sano. Desafortunadamente, estos dos últimos no son adecuados para la exposición repetida de ALI, ya que no permanecen como un monocapa estable con el tiempo. Otra limitación del modelo Calu-3 es que solo representa un solo tipo de celda. En el pulmón humano, hay múltiples tipos de células que interactúan y responden de manera diferente a la exposición. Las partículas inhaladas se depositarán en diferentes regiones de los pulmones dependiendo de su tamaño aerodinámico. Aquí es donde las partículas entran en contacto con la barrera celular epitelial, como imita el modelo Calu-3. En el pulmón humano, los macrófagos alveolares se sienten atraídos por las partículas, las envuelven y las eliminan de los pulmones. Los macrófagos también desempeñan un papel esencial en la respuesta de inflamación a la exposición a partículas. Por lo tanto, se están haciendo esfuerzos para extender el modelo Calu-3 añadiendo macrófagos primarios para imitar la barrera pulmonar más de cerca. La desventaja de los macrófagos es que siguen siendo viables sólo durante unos 7 días cuando se cultivan encima de las células Calu-3 en el ALI. Por lo tanto, los macrófagos deben leerse semanalmente para transformar el actual modelo Calu-3 en un modelo de cocultura. La optimización del protocolo de cocultura está actualmente en curso.
Dado lo anterior, el modelo bronquial Calu-3 es un modelo adecuado para la exposición repetida a aerosoles de sustancias parcialmente solubles como productos químicos del humo del cigarrillo y LPS. Estas sustancias solubles inducen aumentos significativos en las respuestas de citoquinas en las células calu-3. Para probar partículas insolubles como el escape diésel y el DQ12, se necesita un modelo de cocultura, porque los macrófagos desempeñan un papel crucial en la inducción de efectos por exposición a partículas.
Para las exposiciones descritas, se utilizaron membranas de inserción con poros de 3,0 μm. La razón principal para elegir este tipo de plaquita es que es posible probar la translocación de nanomateriales. Cuando se utiliza un tamaño de poro más pequeño de 0,4 μm, los aglomerados de partículas no podrán cruzar la membrana de la plaquita. La desventaja de usar un tamaño de poro grande es que las células necesitan más tiempo para confluentes y que es más difícil visualizar la morfología de las células usando microscopía ligera. Para comprobar que las células forman una monocapa confluente, el TEER debe ser >1.000 Ω x cm2 antes de iniciar una exposición.
En conjunto, el modelo bronquial Calu-3 presentado aquí es adecuado para su uso para la exposición repetida a aerosoles, al menos hasta 3 semanas. El modelo puede soportar ser cultivado y expuesto a través de un flujo de aire continuo y es capaz de detectar toxicidad para el epitelio bronquial.

Los pulmones son vulnerables a la exposición a la inhalación a partículas en el aire. Para evaluar la toxicidad potencial de las partículas en el aire, se ha avanzado en el desarrollo de sistemas de exposición a la interfaz aire-líquido (ALI)1,2,3,4,5. Los sistemas de exposición ALI permiten modelos de exposición más relevantes y realistas en comparación con la exposición sumergida tradicional a través del medio de cultivo que altera las características y cinéticas de las partículas6. Los sistemas de exposición ali ponen demandas específicas en los modelos de cultivo celular, ya que los modelos carecen de medio de cultivo y por lo tanto nutrientes en el lado apical. Muchos modelos celulares se ven afectados negativamente por ser cultivados y expuestos al aire (por ejemplo, secarse) y sólo permanecen viables durante unos días. Esto limita las condiciones de exposición que se pueden utilizar en estos modelos: normalmente se aplican concentraciones relativamente altas en un corto período de tiempo como una nube (es decir, gotas que contienen partículas, que se asientan rápidamente). Estas condiciones experimentales no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas; por lo tanto, la pertinencia de los resultados puede ser cuestionada. Para superar estas limitaciones, se optimizó el protocolo de cultivo y exposición para un modelo bronquial que consiste en la línea celular epitelial bronquial humana Calu-37.
La mayoría de los modelos pulmonares in vitro utilizados para la exposición a ALI contienen otras líneas celulares como A549, BEAS-2B y 16HBE14o- (16HBE) o células primarias como base8. Estas líneas celulares tienen la desventaja de que siguen siendo viables durante sólo unos días cuando se cultivan en el ALI. Además, algunas de estas líneas celulares se sobrecargan cuando se cultivan durante un período superior a 5 días. Por último, las células A549 pierden uniones estrechas funcionales y, por lo tanto, no pueden formar una barrera apretada que se necesita para imitar los pulmones9,10. Las células epiteliales primarias pueden ser una buena opción para la exposición a ALI, ya que pueden ser cultivadas en el ALI durante semanas. Sin embargo, las células primarias difieren de un lote a otro, son más difíciles de mantener y son más costosas en comparación con las líneas celulares, lo que las hace menos adecuadas para las pruebas de toxicidad y la detección. Al comparar diferentes líneas celulares epiteliales bronquiales humanas (16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B), sólo las células Calu-3 cumplen todos los criterios necesarios para la exposición realista y repetida de ALI: siguen siendo viables durante semanas mientras se cultivan en el ALI, proporcionan una alta integridad de barrera, no superan y son fáciles de desarrollar y mantener. Las células Calu-3 se originan a partir de un adenocarcinoma y son capaces de producir moco11,12. Hay inconsistencias en cuanto a si las células pueden desarrollar cilio11,13. Las células Calu-3 también son un modelo adecuado para estudiar infecciones por el virus respiratorio sincitial (RSV) que infectan las células epiteliales de las vías respiratoriasciliadas 14.
Además del modelo celular, se utiliza un sistema automatizado de exposición (AES) para la exposición aire-líquido a aerosoles15,16. El AES tiene la ventaja de que utiliza un flujo de aire continuo para exponer el modelo celular a aerosoles. Esto contrasta con otros sistemas de exposición aire-líquido que suelen utilizar concentraciones relativamente altas en un corto período de tiempo como nube (es decir, gotas que contienen partículas que se asientan rápidamente)17,18,19. Estos sistemas en la nube no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas. Al aplicar un flujo de aire continuo utilizando el AES, el modelo celular puede estar expuesto a una baja concentración de partículas durante un período de tiempo más largo, lo que refleja condiciones de exposición realistas. Otra ventaja sobre los sistemas en la nube es que el AES tiene la opción de conectar instrumentos de caracterización de partículas, lo que permite medir el tamaño de las partículas, la concentración numérica y la masa a lo largo del tiempo. Una limitación del AES es que utiliza flujos de aire relativamente altos entre 10 mL/min y 100 mL/min.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01 M NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M (x10) PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;,7&#8217;-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab141525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated exposure station</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell proliferation reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit LDH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ12</td>
			<td>IOM</td>
			<td></td>
			<td>nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Ready-SET-Go</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>88-8086-86, 88-7399-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td>
			<td>EVOM2-STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow splitter</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>model 3708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate (F-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>MFC, Bronkhorst, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Sartorius, Goettingen, Germany</td>
			<td>ME-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>41090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray nozzle</td>
			<td>Schlick, Coburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon filters</td>
			<td>Pall</td>
			<td>R2PJ46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEOM</td>
			<td>Rupprecht &#38; Patashnick NY, USA</td>
			<td>series 1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>690175, 658175, 660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460, 3462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an air-liquid interface bronchial epithelial model for realistic, repeated inhalation exposure to airborne particles for toxicity testing

Para pruebas de toxicidad de partículas en el aire, se han desarrollado sistemas de exposición a la interfaz aire-líquido (ALI) para pruebas in vitro con el fin de imitar condiciones de exposición realistas. Esto impone demandas específicas a los modelos de cultivo celular. Muchos tipos de células se ven afectados negativamente por la exposición al aire (por ejemplo, secado) y sólo permanecen viables durante unos días. Esto limita las condiciones de exposición que se pueden utilizar en estos modelos: por lo general, las concentraciones relativamente altas se aplican como una nube (es decir, gotas que contienen partículas, que se asientan rápidamente) en un corto período de tiempo. Estas condiciones experimentales no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas. Para superar estas limitaciones se investigó el uso de una línea celular epitelial bronquial humana, Calu-3. Estas células se pueden cultivar en condiciones ali durante varias semanas mientras se conserva una morfología saludable y una monocapa estable con uniones estrechas. Además, este modelo bronquial es adecuado para probar los efectos de las exposiciones repetidas a concentraciones bajas y realistas de partículas en el aire utilizando un sistema de exposición ALI. Este sistema utiliza un flujo de aire continuo en contraste con otros sistemas de exposición a ALI que utilizan una sola nebulización que produce una nube. Por lo tanto, el sistema de flujo continuo es adecuado para la exposición repetida y prolongada a partículas en el aire mientras monitorea continuamente las características de las partículas, la concentración de exposición y la dosis administrada. En conjunto, este modelo bronquial, en combinación con el sistema de exposición continua al flujo, es capaz de imitar condiciones realistas y repetidas de exposición a la inhalación que se pueden utilizar para pruebas de toxicidad.

Este artículo proporciona un método para cultivar y exponer células epiteliales bronquiales humanas en el ALI que imita condiciones realistas de exposición a la inhalación repetida que se pueden utilizar para pruebas de toxicidad. Las características tanto del modelo celular como del sistema de exposición son esenciales para lograr un modelo realista de exposición a la inhalación que pueda utilizarse para exposiciones repetidas. Los resultados sobre estas características se muestran a continuación.
Requisitos y selección del modelo celular
Al seleccionar un modelo de celda adecuado, deben tenerse en cuenta las siguientes características:
<ol><li>El modelo celular debe ser capaz de formar una monocapa confluente con uniones estrechas que funcionen para imitar la barrera pulmonar.</li>
<li>El modelo de celda debe mostrar un rendimiento óptimo cuando se expone repetidamente al aire acondicionado (temperatura y humedad).</li>
<li>El modelo celular debe responder a una exposición.</li>
</ol>Este estudio comenzó con cuatro líneas celulares epiteliales bronquiales humanas diferentes: 16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B. Todos estos son ampliamente utilizados para pruebas de toxicidad de nanomateriales y productos químicos. De las cuatro líneas celulares, sólo las células Calu-3 cumplieron con todos los requisitos anteriores. Las células formaron una monocapa con uniones estrechas(Figura 3)que se mantuvo como una barrera estable con el tiempo medida por TEER, mientras que las otras líneas celulares no formaron una barrera o mostraron una caída en la función de barrera cuando se cultivaban en el ALI (Figura 4). Además, H292 y BEAS-2B tendían a crecer en exceso en varias capas celulares cuando se cultivaban durante un período de tiempo más largo. La culturing tradicional de células sumergidas y la culturing ALI difieren mucho, porque en el lado basolateral los nutrientes ALI sólo estaban disponibles desde el lado basolateral y las células estaban expuestas a condiciones secas en el lado apical. Estas condiciones pueden causar estrés a los modelos celulares, que podrían observarse midiendo la viabilidad celular con el tiempo. Las líneas celulares 16HBE, H292 y BEAS-2B mostraron una mayor liberación de LDH cuando se cultivaban en el ALI, mientras que las células Calu-3 mostraron sólo una ligera liberación de LDH(Figura 5).
A continuación, se probó la respuesta del modelo Calu-3 a las sustancias. Como sustancia de control positiva, lps se administró a través de nebulización en el lado apical del modelo. La dosis depositada fue de 0,25 μg/cm2. Las células calu-3 mostraron una reacción a la lipopolisacárido (LPS) por un aumento en la liberación de LDH y en la liberación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Figura 6).
Finalmente, la monocapa Calu-3 estuvo expuesta a nanomateriales de sílice de cuarzo (DQ12) (OIM, Edimburgo). La sílice cristalina puede inducir silicosis y también puede causar tumores pulmonares. Por lo tanto, la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC) ha clasificado la sílice cristalina como carcinógeno humano del Grupo I20. Se cree que el mecanismo de acción de la sílice cristalina es a través de la inducción de inflamación persistente causada por su superficie reactiva21,22,23. Varios estudios in vivo tanto en ratas como en ratones reportan la inducción de cambios de inflamación e histopatología, incluyendo tumores y fibrosis, después de la exposición por inhalación a sílice cristalina24,25,26,27,28,29. Todos estos efectos se observan después de la exposición repetida y/o seguimiento a largo plazo. El modelo Calu-3 se utilizó para investigar si las observaciones de los estudios in vivo podían ser imitadas usando un modelo in vitro que podría ser expuesto repetidamente en el ALI.
Las células calu-3 estuvieron expuestas durante 3 semanas consecutivas, 5 días por semana, 4 h por día a DQ12. La dosis depositada se midió utilizando un QCM. La dosis media depositada fue de 120 ng/cm2 al día, con una dosis acumulada de 1,6 μg/cm2,similar a las dosis que inducen un efecto in vivo. Otras características de partículas se muestran en la Tabla 1. Después de 3 semanas de exposición, DQ12 no indujo efectos significativos en teer, viabilidad celular, y la liberación de proteína quimioattractante monocito 1 (MCP-1), en comparación con los controles de aire limpio (Figura 7). A medida que se esperaba una mayor toxicidad del DQ12 basada en los datos in vivo, la reactividad de las partículas se comprobó mediante un ensayo acelular de acuerdo con el protocolo optimizado dentro del proyecto de la UE GRACIOUS (entregable 5.3). La reactividad del lote DQ12 fue menor de lo esperado(Figura 8),órdenes de magnitudes menores en comparación con las partículas de control positivas negro de carbono (CB). Esta falta de reactividad podría explicar la ausencia de una respuesta de toxicidad en el modelo Calu-3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig01.jpg"> Figura 1: La estación de exposición automatizada (AES). La figura izquierda muestra el exterior del armario con el panel táctil. El AES tiene tres niveles con módulos de exposición: el nivel superior para exposiciones de aire limpio y el nivel medio e inferior para exposiciones a aerosoles. La figura correcta muestra el módulo de exposición en el que se colocan las plaquitas con celdas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig02.jpg"> Figura 2: Representación esquemática de la configuración de exposición. De izquierda a derecha: 1) la suspensión ENM conectada a la boquilla de pulverización a través de una bomba peristáltica; 2) El uso de aire comprimido la boquilla de pulverización nebuliza la suspensión ENM y a través de una cámara de mezcla los aerosoles se llevan a la AES; 3) Justo antes de entrar en el AES, los instrumentos de caracterización de aerosoles están conectados: SMPS, OPS, CPC y TEOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig03.jpg"> Figura 3: Imagen representativa de las células Calu-3 después de la culturing en la interfaz aire-líquido (ALI) durante 10 días. Imagen microscopía de fluorescencia de células Calu-3 después de cultivar en el ALI durante 10 días. La proteína de unión estrecha ZO-1 está manchada en verde, los núcleos de las células están manchados de azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig04.jpg"> Figura 4: Resistencia eléctrica transepithelial (TEER) de cuatro líneas celulares diferentes durante un período de cultivo de 21 días. Valores TEER de 16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B cuando se cultivan durante 21 días: primeros 7 días sumergidos, seguidos de 14 días en el ALI. Los valores TEER se corrigieron para la resistencia de fondo de la plaquita y se multiplicaron por el área de superficie de la plaquita. Los símbolos y las barras de error representan el valor medio y la desviación estándar de seis inserciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig05.jpg"> Figura 5: Liberación LDH de cuatro líneas celulares diferentes durante un período de cultivo de 21 días. Lanzamiento LDH de 16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B cuando se cultiva durante 21 días: 7 días sumergidos, seguido de 14 días en el ALI. Los valores LDH mostrados son relativos a la liberación máxima de LDH por tipo de celda. Los símbolos y las barras de error representan el valor medio y la desviación estándar de cinco inserciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig06.jpg"> Figura 6: Efectos celulares en células Calu-3 expuestas a LPS. Las células calu-3 fueron expuestas a través de la nebulización de la nube a 0,25 μg/cm2 LPS. (A) La conversión WST-1. (B) Liberación LDH. (C) Liberación de TNF-α después de la exposición a LPS. Los símbolos y las barras de error representan valores medios y desviaciones estándar de tres inserciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig07.jpg"> Figura 7: Efectos celulares en células Calu-3 expuestas a nanomateriales DQ12. Las células Calu-3 estuvieron expuestas durante 3 semanas (4 h por día, 5 días a la semana) a nanomateriales DQ12, aproximadamente 120 ng/cm2 por día, dosis acumulada de 1,6 μg/cm2. (A) valores TEER. (B) Liberación LDH. (C) Liberación mcp-1 después de la exposición DQ12. Todos los símbolos y barras de error representan valores medios y desviaciones estándar de tres inserciones para los controles y seis insertos para la exposición DQ12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig08.jpg"> Figura 8: Reactividad acelular del DQ12. DQ12 fue incubado con una sonda 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) para detectar su reactividad superficial. Como control positivo, se incluyeron partículas de negro carbón (CB). En comparación con CB, DQ12 tiene una reactividad superficial muy baja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Masa de partículas (μg/m3)</td>
			<td>Número de partícula (#/cm3)</td>
			<td>Tamaño de partícula de movilidad (nm)</td>
			<td>Desviación estándar geométrica</td>
			<td>Tamaño de partícula óptica (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2969 (418)</td>
			<td>83983 (10215)</td>
			<td>66.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.1 (1.3)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Características de exposición DQ12. Los valores se muestran como promedio con desviación estándar entre corchetes.

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An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.

Un modelo epitelial bronquial de interfaz aire-líquido para la exposición realista y repetida por inhalación a partículas en el aire para pruebas de toxicidad

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

an-air-liquid-interface-bronchial-epithelial-model-for-realistic

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vistas.  National Institute for Public Health and the Environment (RIVM). Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.

Video: An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Investigación

Biología

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Whole-Body nanopartículas exposición por inhalación de aerosoles

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocolo experimental para el uso de Drosophila como sistema modelo de invertebrado para ensayos de toxicidad en el laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolos para las pruebas de la toxicidad de la novela química insecticida para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Ensayo de sobresalto para la evaluación de la toxicidad en embriones de pez cebra

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

Autor destacado: Cribado de toxicidad de alto rendimiento mediante el ensayo de respuesta de sobresalto de embriones de pez cebra

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

Evaluación de la toxicidad de los productos químicos mediante un sistema de detección de la respuesta al sobresalto por vibración del pez cebra

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...