Este protocolo es significativo, ya que el PIVEC permite la exposición directa de un cultivo celular a aerosoles del mundo real. El sistema puede ser advertido para tomar muestras del mismo aire que una persona respira, lo que permite un nuevo tipo de monitoreo de la calidad del aire. La principal ventaja de esta técnica es la facilidad de capturar aerosoles en células pulmonares cultivadas en lugares inaccesibles para los sistemas de sobremesa, como en la fuente de admisión o dentro de la zona de respiración.
Lynn Secondo, una recién graduada de mi laboratorio, y Nathaniel Wygal, un estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para este experimento, almacenó los materiales de prueba y el entorno controlado durante 24 horas antes de la prueba. Para montar el sistema de dispersión en seco, conecte la válvula de bola a un extremo de la tubería roscada de cuatro pulgadas de largo y tamaño 1/8.
Esto sirve como la tolva de partículas. A través del extremo abierto de la tolva de partículas, poner en la cantidad deseada de nanopartículas de cobre. A continuación, cierre la tolva de partículas con otra válvula de bola.
Conecte el tubo de dos pulgadas de largo, tamaño 1/8 a la válvula. Coloque un tubo exterior de tres pulgadas de largo y media pulgada alrededor del tubo de dos pulgadas. Inserte un filtro HEPA dentro del tubo corto, asegurando que la dirección del flujo sea a través de la válvula de bola.
Con el roscado, conecte el generador de vacío a la otra válvula de bola. A continuación, conecte el generador de vacío al tanque de aire. Coloque tubos de diámetro exterior de 1/4 de pulgada sobre la salida del generador de vacío para conectarlo a la configuración experimental.
Gire la válvula principal y las válvulas reguladoras del tanque de aire para ajustar el flujo deseado. Abra la válvula de bola, más cercana al filtro HEPA y luego abra la válvula de bola más cercana al generador de vacío. Manténgalos abiertos durante la caracterización o exposición antes de cerrarlos.
Primero la válvula de bola más cercana al generador de vacío, y luego la válvula de bola más cercana al filtro HEPA. Cierre las válvulas principales y reguladoras del tanque de aire para detener el flujo. Para limpiar, utilice 70% de etanol para lavar las válvulas de bola y el generador de vacío.
Ponga tubos metálicos en el autoclave para la esterilización. Después de cultivar las células en la interfaz del líquido del aire, permita que las células se equilibren durante 24 horas. Para montar, tome la base PIVEC con el pozo hacia arriba y conecte el adaptador de plaquita de cultivo celular en la parte superior.
Añadir cuatro mililitros de medios de cultivo celular al pozo de la base del PIVEC utilizando una micropipeta. Utilice pinzas para colocar el inserto de referencia cultural de celda dentro del adaptador. Con la parte estrecha de la pieza superior PIVEC hacia arriba, conéctese al adaptador.
Envuelva cuidadosamente PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva. Empuje para conectar piezas de cassette de 37 milímetros en la parte superior e inferior de PIVEC. Coloque adaptadores de púas de 1/4 de pulgada en la entrada y salida del cassette.
Envuelva el calentador resistivo alrededor de PIVEC con los cables en la base. Cinta para asegurar. Envuelva PIVEC con ocho rondas de papel de aluminio para aislamiento y asegúrelo con cinta adhesiva.
Conecte el tubo de diámetro exterior de 1/2 pulgada al adaptador en la parte superior de PIVEC. Retire el tubo poroso del agua estéril y colóquelo dentro del tubo en la parte superior de PIVEC. Sistema de transferencia a la campana de humo y sujetar el PIVEC en el soporte del anillo y asegurar.
Conecte PIVEC al sistema de aerosol conectando el tubo de 1/4 de pulgada de diámetro a la salida del generador de aerosoles al tubo poroso. Conecte la salida del PIVEC a un tubo de 1 x 4 pulgadas de diámetro que esté conectado a un filtro HEPA y a una bomba de vacío mediante un conector Y. Encienda las válvulas y ajuste el caudal de la bomba a 0,5 litros por minuto.
Exponga las células a nanopartículas de cobre durante diez minutos antes de cerrar las válvulas y apagar la bomba. Retire PIVEC del sistema de aerosoles. Saque el inserto de cultivo celular con pinzas y colóquelo en la placa de pozo estéril para comenzar los ensayos biológicos deseados.
Puntos de tiempo de exposición propuestos, vuelva a colocar el inserto en la incubadora de dióxido de carbono. Aspirar medios de PIVEC con un cuentagotas. Utilice 70%etanol para lavar PIVEC y esterilizarlo con luz ultravioleta durante al menos 30 minutos antes del siguiente experimento.
El PIVEC se caracterizó utilizando tres tamaños de nanopartículas de cobre para determinar la eficiencia de la deposición. El aumento de la deposición se observa en general para el diseño de 24 pozos, luego el diseño de seis pozos. Disminuye ligeramente para 100 nanómetros en comparación con 40 nanometros y 800 nanometros de partículas de cobre.
La concentración del número de partículas de aerosoles de nanopartículas de cobre se determinó mediante un dimensionador de partículas de movilidad de escaneo basado en filtros, así como mediciones de tamaño de partícula óptica. El análisis posterior a la exposición se puede acelerar determinando la relación de dosis entre el filtro de 37 milímetros y el inserto de cultivo celular. La comparación muestra una fuerte correlación para partículas de cobre de 800 nanómetros con un valor p inferior a 0,05.
En comparación con los sistemas de exposición in vitro de flujo perpendicular en toda la literatura, la eficiencia de la deposición del PIVEC en el rango de los tamaños de partículas probados es comparable o aumenta con los valores notificados. Lo más importante a recordar es que aunque este protocolo demuestra el uso del PIVEC en un entorno de laboratorio, fue diseñado para medir las respuestas celulares a los aerosoles en el lugar de exposición. Al realizar pruebas in situ, es importante caracterizar la eficiencia de la deposición del aerosol de prueba.
La eficiencia de la deposición determina la dosis depositada de partículas a las que están expuestas las células. Se pueden realizar ensayos biológicos adicionales para investigar más puntos finales de respuesta celular debido a la exposición. El PIVEC se ha utilizado para evaluar la respuesta celular debido a aerosoles generados durante los procesos de impresión 3D, como el chorro de aglutinante de metal, y la fabricación de filamentos fusionados.
El uso de nanopartículas, particularmente en forma de aerosol, puede ser peligroso y cualquier exposición debe realizarse en una campana de humos. El trabajo celular debe realizarse en un gabinete de biosemase.
