Este protocolo es para un método robusto y rentable que se puede utilizar para abordar una variedad de preguntas de investigación relacionadas con la función y el papel de las células epiteliales de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que da como resultado una capa celular que es una buena representación de la capa de células epiteliales humanas, incluida la producción de moco y la actividad ciliar. Esta técnica es versátil y se puede utilizar para estudiar insultos relacionados con enfermedades o terapias.
Para comenzar, enjuague el anillo bronquial aislado del tejido pulmonar humano con 10 mililitros de PBS estéril en una placa de Petri de 10 centímetros. Mientras sostiene el anillo con pinzas, use tijeras pequeñas para eliminar cualquier exceso de tejido conectivo y restos de sangre. Corte el anillo en dos y sumerja dos mitades en 10 mililitros de solución de proteasa 14 precalentada en HBSS que contenga primocina en un recipiente estéril cerrado.
Incubar las piezas del anillo bronquial a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, transfiera las piezas a una placa de Petri que contenga 10 mililitros de PBS caliente, y usando pinzas dobladas, raspe el interior del anillo para obtener una solución celular. Deseche el anillo.
Transfiera la solución celular a un tubo de 50 mililitros y agregue PBS caliente para obtener un volumen final de 50 mililitros. Centrifugar la solución celular y aspirar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 10 mililitros de PBS caliente. Enrasar el volumen a 50 mililitros con PBS, y repetir la centrifugación.
Vuelva a suspender el pellet en KSFM completo caliente que contenga Primocin. A continuación, reemplace la solución de recubrimiento de la placa de seis pocillos con dos mililitros de suspensión celular por pocillo. Permita que las células crezcan hasta alcanzar una confluencia del 80 al 90%, Para la criopreservación de PBEC, aspire el medio de los pocillos y lave las células una vez con dos mililitros de PBS caliente por pocillo.
Tripsinizar las células añadiendo 500 microlitros de tripsina blanda por pocillo e incubar durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados. Agite la solución de tripsina y libere las células golpeando suavemente la placa. Transfiera las células separadas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga un inhibidor de tripsina de soja.
Centrifugar la suspensión y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 10 mililitros de KSFM que contienen penicilina y estreptomicina. Después de contar las células en un contador de células automatizado, vuelva a suspender las células a una concentración de 400, 000 células por mililitro en un medio de congelación y agregue un mililitro de esta suspensión en un criovial. Transfiera los viales a un recipiente de celda fría y colóquelos a menos 80 grados centígrados.
Después de 24 horas, transfiera los viales a menos 196 grados centígrados de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Para recubrir un matraz de cultivo celular T75, añadir 10 mililitros de solución de recubrimiento en PBS y cerrar bien la tapa antes de colocar el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, sustituya la solución de recubrimiento del matraz por 10 mililitros de KSFM completo.
Deje que el medio se caliente a 37 grados centígrados en la incubadora con una tapa ligeramente abierta para dejar entrar el aire de la incubadora. Descongele rápidamente los PBEC criopreservados en un baño de cuentas de 37 grados centígrados. Añadir todo el contenido al matraz T75 precalentado y distribuir las células uniformemente.
Después de asegurarse de que las células estén firmemente unidas, reemplace el medio con 10 mililitros de KSFM completo fresco y caliente, y hágalas crecer hasta que se alcance una confluencia del 80 al 90%. Recubra los insertos de cultivo celular agregando 400 microlitros de solución de recubrimiento por inserto e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Tripsinizar los PBEC en el matraz añadiendo dos mililitros de tripsina blanda, e incubar durante cinco a 10 minutos.
Facilitar el desprendimiento de células girando y golpeando suavemente el matraz. A continuación, agregue cuatro mililitros de inhibidor de tripsina de soja al matraz y transfiera la suspensión celular a un tubo de 25 mililitros. Centrifugar la suspensión y volver a suspender el pellet en seis mililitros de medio BD completo.
Cuente las celdas en un contador de celdas automatizado. Después del recubrimiento, retire la solución de recubrimiento de los insertos. Diluir la suspensión celular con medio BD completo suplementado con un nanomol EC 23 y añadir 500 microlitros en la parte superior de la membrana de los insertos.
Agregue 1.5 mililitros de medio BD completo al pozo debajo del inserto. Cuando las células estén listas para la transferencia a la interfaz aire-líquido, o ALI, retire el medio de los insertos y del pozo, y agregue un nuevo medio BD completo complementado con 50 nanomolares EC 23 solo al pozo. Cambie el medio en los pozos tres veces por semana.
Para eliminar el exceso de moco y desechos celulares, agregue suavemente 200 microlitros de PBS caliente en el lado apical de la capa celular dentro del inserto e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, aspire el PBS que contiene exceso de moco y restos celulares. TEER se midió para evaluar la calidad de los cultivos ALI PBEC.
A los siete días, la resistencia eléctrica de la capa celular superior a 300 ohmios se considera un cultivo exitoso. Además, la variabilidad entre donantes en la resistencia eléctrica se redujo con el tiempo entre el día siete y el día 14 de cultivo en la interfaz aire-líquido, y está marcadamente influenciada por el origen del DMEM utilizado. Todos los principales tipos de células diferentes, como las células basales, ciliadas, caliciformes y clubes, se observaron a los 14 días de cultivo de ALI, y los niveles de expresión fueron dependientes del donante.
Entre las diferentes concentraciones de EC 23 probadas, se observó TEER máximo a 50 nanomolares. Una comparación del ácido retinoico y su análogo sintético, EC 23, confirma que la expresión génica de los marcadores para células ciliadas y caliciformes fue similar entre 50 nanomolares EC 23 y ácido retinoico. El uso de medios de diferentes proveedores dio lugar a diferencias sustanciales en la composición celular, mientras que las diferencias en TEER fueron menos pronunciadas.
Por otro lado, el uso de insertos de diferentes proveedores no dio lugar a diferencias sustanciales en la descomposición celular. Además, también se observó una diferencia en los valores de TEER y la composición celular del ALI PBEC y el medio PneumaCult en comparación con el medio BD completo. Cuando las células estén listas para transferirse a ALI, aumente las concentraciones de EC 23.
Además, no centrifugue las células después de la descongelación y retire rápidamente las células de los plásticos de cultivo celular después de agregar SBTI. Usando cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias de la manera provista en este protocolo, puede seguir eso utilizando una variedad de métodos de análisis para observar, por ejemplo, la función, la expresión génica, la producción mediadora de las células epiteliales de las vías respiratorias y, por lo tanto, por ejemplo, obtener información sobre las consecuencias de la exposición a, por ejemplo, el humo del cigarrillo. Los próximos pasos para este protocolo de cultivo celular es la integración de tipos de células adicionales, como células inmunes o células vasculares, y esto ayudará a aumentar la representación tisular.
