Nuestro protocolo es significativo porque permite a los investigadores que trabajan en hongos no modelo la oportunidad de establecer tecnologías de edición del genoma de vanguardia en sus laboratorios. Como no se basa en técnicas existentes, como los sistemas de expresión, este protocolo tiene la ventaja de ser más fácil de establecer en sistemas que no son modelo. Este método se puede utilizar en diferentes especies de hongos y se puede utilizar para dilucidar funciones de genes implicados en el apareamiento de la vía, crecimiento, y patogenicidad.
Por lo tanto, al realizar este procedimiento, uno debe estar seguro de tener suficientes días consecutivos para competir con el protocolo, ya que sólo hay unos pocos puntos en el experimento en los que se puede pausar. Para cosechar la conidia, filtre el cultivo líquido a través de una capa de tela de laboratorio estéril en tubos centrífugos de 50 mililitros para la centrifugación. Resuspender el pellet de conidia en cinco mililitros de agua y ver una alícuota de 10 microlitros de la solución de conidio bajo un microscopio de luz a un aumento de 40X para confirmar que sólo se han recuperado conidios.
A continuación, añada 200 mililitros de caldo de extracto de malta 1% fresco a un matraz de 500 mililitros y transfiera todo el volumen de conidia al matraz. Luego incubar el cultivo líquido hasta 12 horas en una incubadora de temblores de 25 grados Celsius a 120 revoluciones por minuto. Para cosechar los germens, transfiera el cultivo a tubos de centrífuga de 50 mililitros para la centrifugación y resusppend los germens en hasta 10 mililitros de un sorbitol molar.
Añadir un mililitro de solución germinal a diversas concentraciones de solución enzimática e incubar la solución enzimática de esporas durante dos o tres horas en la incubadora de agitación a 80 revoluciones por minuto. Para cosechar los protoplastos, filtre la solución enzimática a través de una capa de tela de laboratorio estéril y recoja los protoplastos por centrifugación. A continuación, resuspender cuidadosamente el pellet de protoplasto en 200 microlitros de tampón STC y comprobar una alícuota de 10 microlitros de la solución bajo un microscopio para confirmar que sólo se han recuperado protoplastos.
Para comenzar la transformación, combine aproximadamente cinco veces 10 a los seis protoplastos con un solo volumen de solución de ribonucleoproteína y aproximadamente seis microgramos del fragmento de ADN del donante. A continuación, utilice una pipeta para gotear lenta y uniformemente un mililitro de solución 30%PTC recién preparada sobre la suspensión protoplasta para crear una capa hidrófoba sobre los protoplastos e incubar la solución durante 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añadir cinco mililitros de medio de control osmótico a la suspensión protoplástica, pipeteando lentamente y suavemente para mezclar a fondo la solución.
Después de mezclar, incubar la solución de protoplasto en la incubadora de agitación a 80 revoluciones por minuto durante la noche. A la mañana siguiente, divida la solución entre cinco placas de cultivo de 60 milímetros. Añadir 10 mililitros de agar medio de control osmótico complementado con 30 microgramos por mililitro de higromicina B a cada plato y girar lentamente cada plato para mezclar.
Permita que la primera capa de agar se ajuste antes de añadir 10 mililitros de agar medio de control osmótico complementado con 40 microgramos por mililitro de higromicina B dos cada placa. Después de permitir que la segunda capa de agar se establezca, incubar los cultivos a 25 grados celsius hasta que se puedan observar aislados individuales creciendo a través de ambas capas de agar. Para recuperar los aislados transformados con éxito, transfiera los aislados individuales con capacidad de crecimiento a placas de agar de extracto de malta fresca complementadas con 50 microgramos por mililitro de Higromicina B.To evaluar los efectos de la alteración genética dirigida en las capacidades heterotálicas del hongo, co-inocular medio de agar extracto de malta fresca con una cepa mutante, así como una cepa del tipo de acoplamiento opuesto.
Cuando trabaje con H.omanensis, cubra pero no selle las placas. Coloque las placas a temperatura ambiente durante siete días. Al final de la incubación, evaluar visualmente para la producción de estructuras sexuales.
Para probar las capacidades homotálicas de la cepa mutante, inocular el medio de agar extracto de malta fresca con la cepa mutante de interés e incubar la placa a temperatura ambiente durante una semana como se ha demostrado. Para evaluar los efectos de la interrupción en la tasa de crecimiento del hongo que se está estudiando, inserte la parte posterior de una gran punta de pipeta estéril en los bordes de crecimiento activo del cultivo de cada cepa de interés mutante y salvaje para crear tapones de agar cubiertos de miceliales e inocular un medio de agar extracto de malta fresca. Se deben realizar al menos tres réplicas por tipo de referencia cultural.
Después de tres días de crecimiento a 20 grados centígrados, medir el crecimiento en cada placa en dos diámetros perpendiculares. Las conidias utilizadas como material de partida para el protocolo pueden germinar y crecer hasta que se conviertan en gérmenes jóvenes. Tenga en cuenta que las hebras miceles maduras como estas son demasiado maduras para la degradación y no deben utilizarse.
Cuando las células ya no tienen paredes celulares, se vuelven muy sensibles a la interrupción mecánica y liberan protoplastos redondos que se pueden cosechar para su transformación. El éxito del protocolo se puede confirmar tras un análisis fenotípico de las cepas mutantes. Para este aislado mutante MAT 127, la tasa de crecimiento radial vegetativo se redujo significativamente, lo que sugiere un efecto pleiotrópico para el nuevo gen de apareamiento.
Además, el aislado mutante era incapaz de completar un ciclo sexual produciendo sólo estructuras sexuales inmaduras que no producían esporas sexuales en comparación con el aislado de tipo salvaje que completó todo el ciclo sexual dentro de unos pocos días de la incubación. El ARN es muy sensible y se degrada muy fácilmente. Por lo tanto, un ambiente de trabajo limpio y trabajar rápidamente en hielo son esenciales para el éxito de este experimento.
Una vez que el aislado mutante se ha generado con éxito, pueden ser sometidos a análisis fenotípicos o ARN-seq según corresponda para el gen que se está caracterizando.
