CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

私たちのプロトコルは、非モデル菌に取り組む研究者が研究室で最先端のゲノム編集技術を確立する機会を与えるので、重要です。式システムなどの既存の手法に依存しないため、このプロトコルは非モデルシステムでの確立が容易であるという利点があります。この方法は、異なる真菌種にわたって使用することができ、経路交配、成長、および病原性に関与する遺伝子の機能を解明するために使用することができます。

したがって、この手順を実行する場合、プロトコルを一時停止できる数ポイントしかないので、プロトコルを競合させるためには、十分な連続日数を確保する必要があります。コニディアを収穫するには、無菌実験室布の層を通して、遠心分離のために50ミリリットル遠心分離管に液体培養物をろ過する。5ミリリットルの水でコニディアペレットを再懸濁し、コニディア溶液の10マイクロリットルのアリコートを40倍の倍率で光学顕微鏡で見て、コニディアだけが回収されたことを確認します。

次に、新鮮な1%の麦芽エキススープを500ミリリットルフラスコに200ミリリットル加え、コニディアの全容をフラスコに移します。その後、1分間に120回転で25°Cの振動インキュベーターで液体培養を最大12時間インキュベートします。胚芽を収穫するには、遠心分離のために50ミリリットル遠心分離管に培養を移し、1つのモルソルビトールの最大10ミリリットルで発芽を再懸濁させる。

各種濃度の酵素溶液に1ミリリットルの発芽液を加え、1分間に80回転で振る培養器で2〜3時間胞子酵素溶液をインキュベートします。プロトプラストを収穫するには、無菌実験室布の層を通して酵素溶液を濾過し、遠心分離によってプロトプラストを収集する。次に、200マイクロリットルのSTCバッファーでプロトプラストペレットを慎重に再懸濁し、プロトプラストのみが回収されたことを確認するために、顕微鏡下で溶液の10マイクロリットルのアリコートをチェックします。

変換を開始するには、約5回10〜6個のプロトプラストを、1つのリボヌクレオタンパク質溶液と約6マイクログラムのドナーDNA断片と組み合わせます。次に、ピペットを使用して、作りたての30%PTC溶液をプロトプラスト懸濁液にゆっくりと均等に滴下し、プロトプラストの上に疎水性層を作成し、室温で20分間溶液をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、プロトプラスト懸濁液に5ミリリットルの浸透制御培地を加え、ゆっくりと穏やかにピペットして溶液を完全に混合する。

混合後、一晩80回転/分で振るインキュベーターにプロトプラスト溶液をインキュベートする。翌朝、溶液を5つの60ミリメートル培養プレートに分ける。各プレートにハイグロマイシンBのミリリットルあたり30マイクログラムを添加した浸透性対照培地寒天の10ミリリットルを加え、各プレートをゆっくりと回転させて混合します。

寒天の最初の層は、ハイグロマイシンB2つのプレートのミリリットルあたり40マイクログラムを補った浸透性対照培地寒天の10ミリリットルを追加する前に設定することを許可します。寒天の第2層をセットにした後、単一の分離株が寒天の両方の層を通して成長するのを観察することができるまで、摂氏25度で培養をインキュベートする。正常に変換された単離株を回復するために、個々の成長可能な分離株を、ハイグロマイシンの1ミリリットル当たり50マイクログラムを補った新鮮な麦芽抽出寒天プレートに移 B.Toし、真菌のヘテロトアリック能力に対する標的遺伝子破壊の影響を評価し、1つの突然変異株を有する新鮮な麦芽抽出物アガー培地と反対の交配タイプの株を評価する。

H.omanensisで作業する場合は、蓋をしますが、プレートを密封しないでください。プレートを室温で7日間置きます。インキュベーションの終わりに、性的構造の産生を視覚的に評価する。

変異株のホモタール性能力を試験するために、目的の変異株を有する新鮮な麦芽抽出物寒天培地を接種し、実例のように室温でプレートをインキュベートする。研究されている真菌の増殖速度に対する破壊の影響を評価するには、大きな無菌ピペットチップの裏側を、関心のある各変異体および野生型株の培養の積極的に成長するエッジに挿入して、骨髄で覆われた寒天プラグを作成し、新鮮な麦芽抽出物寒天培地を接種する。カルチャの種類ごとに少なくとも 3 つのレプリケートを実行する必要があります。

摂氏20度で3日間の成長の後、2つの垂直直径の各プレートの成長を測定する。プロトコルの出発材料として使用されるConidiaは、彼らが若い胚芽になるまで発芽し、成長することが許可されています。このような成熟した骨髄ストランドは、劣化には成熟しすぎて使用しないでください。

細胞がもはや細胞壁を持っていないとき、それらは機械的破壊に非常に敏感になり、変形のために収穫することができる丸いプロトプラストを放出する。プロトコルの成功は、変異株のフェノールト分析で確認することができる。この変異MAT127単離について、栄養径成長速度が有意に低下し、新規交配遺伝子に対する多雄性作用を示唆した。

さらに、変異型分離株は、インキュベーションの数日以内に性的サイクル全体を完了した野生型の分離株と比較して、性的胞子を産生しない未熟な性的構造のみを産生する性的サイクルを完了することができない。RNAは非常に敏感であり、非常に容易に分解する。したがって、クリーンな作業環境と氷の上で迅速に作業することは、この実験の成功に不可欠です。

変異型分離物が正常に生成されると、それらは特徴付けられる遺伝子に適した表現型またはRNA-seq分析を行うことができる。