بروتوكولنا مهم لأنه يسمح للباحثين العاملين على الفطريات غير النموذجية بفرصة إنشاء تقنيات تحرير الجينوم المتطورة في مختبراتهم. وبما أنه لا يعتمد على التقنيات الموجودة، مثل نظم التعبير، فإن هذا البروتوكول له ميزة كونه أسهل في تأسيسها في الأنظمة غير النموذجية. يمكن استخدام هذه الطريقة عبر أنواع فطرية مختلفة ويمكن استخدامها لتوضيح وظائف الجينات المشاركة في تزاوج المسار والنمو والامراضية.
لذلك عند تنفيذ هذا الإجراء، يجب على المرء أن يكون متأكدا من أن يكون ما يكفي من أيام متتالية من أجل المنافسة في البروتوكول كما أن هناك فقط بضع نقاط في التجربة التي يمكن أن توقف. لحصاد conidia، تصفية الثقافة السائلة من خلال طبقة من القماش المختبري العقيمة في أنابيب الطرد المركزي 50 ملليلتر للطرد المركزي. Resuspend بيليه conidia في خمسة ملليلتر من الماء وعرض 10 ميكرولتر aliquot من الحل conidia تحت مجهر خفيف في التكبير 40X للتأكد من أن conidia فقط قد تم استردادها.
بعد ذلك، أضف 200 ملليلتر من مرق استخراج الشعير الطازج بنسبة 1٪إلى قارورة 500 ملليلتر ونقل الحجم الكامل من conidia إلى القارورة. ثم احتضان الثقافة السائلة لمدة تصل إلى 12 ساعة في 25 درجة مئوية تهز حاضنة في 120 ثورة في الدقيقة الواحدة. ولجني هذه الهبات، قم بنقل الثقافة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي سعة 50 ملليلتراً للطرد المركزي وإعادة بناء الترباتات في ما يصل إلى 10 ملليلترات من سوربيتول واحد مولر.
إضافة ملليلتر واحد من حل يبذر لمختلف تركيزات من محلول انزيم واحتضان محلول انزيم بوغ لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في حاضنة تهز في 80 ثورة في الدقيقة الواحدة. لحصاد الـ بروتبلاستس، قم بتصفية محلول الإنزيم من خلال طبقة من قماش المختبر العقيم وجمع البلاستومات بواسطة الطرد المركزي. ثم إعادة بناء بيليه طلّاب في 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت STC والتحقق من 10 ميكرولتر أليكوت من الحل تحت المجهر للتأكد من أنه تم استرداد فقط البروتبلاستات.
لبدء التحول، والجمع بين ما يقرب من خمس مرات 10 إلى ستة بروتبلاستس مع حجم واحد من محلول ribonucleoprotein وحوالي ستة ميكروغرام من جزء الحمض النووي المانح. بعد ذلك ، استخدم ماصة ببطء وبزات متساوية من ملليلتر واحدة من محلول PTC المعد حديثًا بنسبة 30٪ على تعليق protoplast لإنشاء طبقة مبيدة للماء فوق البلاستات واحتضان الحل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، إضافة خمسة ملليلتر من التحكم التناضحي المتوسطة إلى تعليق بروبلاست، الأنابيب ببطء وبلطف لخلط شامل الحل.
بعد الاختلاط، احتضان حل بروبلاست في حاضنة تهتز في 80 ثورة في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، تقسيم الحل بين خمسة لوحات ثقافة 60 ملليمتر. إضافة 10 ملليلتر من التحكم osmotic متوسطة أجار تكملها 30 ميكروغرام لكل ملليلتر من Hygromycin B إلى كل لوحة وتدوير ببطء كل لوحة لخلط.
السماح للطبقة الأولى من أجار لتعيين قبل إضافة 10 ملليلتر من التحكم osmotic متوسطة agar تكملها 40 ميكروغرام لكل ملليلتر من Hygromycin B اثنين كل لوحة. بعد السماح للطبقة الثانية من أجار لتعيين، احتضان الثقافات في 25 درجة مئوية حتى العزل واحد يمكن ملاحظتها تنمو من خلال كل من طبقات من أجار. لاستعادة العزلات المحولة بنجاح ، نقل العزلات القادرة على النمو الفردية إلى استخراج ألواح الشعير الطازجة agar المكملة بـ 50 ميكروغرامًا لكل ملليلتر من Hygromycin B.To تقييم آثار اضطراب الجينات المستهدفة على القدرات غير المتغايرة للفطريات ، والشعير الطازج المشارك استخراج Agar المتوسط مع سلالة متحولة واحدة بالإضافة إلى سلالة من نوع التزاوج المعاكس.
عند العمل مع H.omanensis، وتغطية ولكن لا ختم لوحات. ضع اللوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة سبعة أيام. في نهاية الحضانة ، تقييم بصريا لإنتاج الهياكل الجنسية.
لاختبار قدرات متجانسة من سلالة متحولة، تلقيح الشعير الطازج استخراج أغار المتوسطة مع سلالة متحولة من الاهتمام واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد كما هو موضح. لتقييم آثار التعطيل على معدل نمو الفطريات التي يجري دراستها ، أدخل المؤخر من طرف ماص معقمة كبيرة في حواف النمو بنشاط لثقافة كل سلالة من نوع متحولة والبرية من المصلحة لإنشاء مقابس أجار مغطاة بالفطرية واستطعاب الشعير الطازج استخراج وسيطة أجار. يجب إجراء ثلاثة نسخ متماثلة على الأقل لكل نوع ثقافة.
بعد ثلاثة أيام من النمو في 20 درجة مئوية، وقياس النمو في كل لوحة على اثنين من أقطار عمودي. يسمح Conidia المستخدمة كمادة البداية للبروتوكول أن تنبت وتنمو حتى تصبح باتات الشباب. لاحظ أن خيوط mycelial ناضجة مثل هذه هي ناضجة جداً للتدهور ولا ينبغي استخدامها.
عندما الخلايا لم يعد لها جدران الخلايا، فإنها تصبح حساسة جداً لاضطرابات الميكانيكية وإطلاق البلاستات المستديرة التي يمكن حصادها للتحول. ويمكن تأكيد نجاح البروتوكول على تحليل ظاهري من سلالات متحولة. لهذا عزل MAT 127 متحولة، تم تخفيض معدل النمو الشعاعي الخضري بشكل كبير، مما يشير إلى تأثير pleiotropic لجين التزاوج الرواية.
وعلاوة على ذلك، كان عزل متحولة غير قادر على إكمال دورة جنسية تنتج فقط الهياكل الجنسية غير ناضجة التي لا تنتج الجراثيم الجنسية بالمقارنة مع عزل من النوع البري الذي أكمل الدورة الجنسية بأكملها في غضون بضعة أيام من الحضانة. الجيش الملكي النيبالي حساس جدا ويتحلل بسهولة جدا. لذلك، بيئة عمل نظيفة والعمل بسرعة على الجليد على حد سواء ضرورية لنجاح هذه التجربة.
مرة واحدة تم إنشاء عزل متحولة بنجاح، فإنها يمكن أن تخضع لتحليل فينوتيبيك أو RNA-seq كما هو مناسب للجين يجري وصفها.
