El accidente cerebrovascular isquémico es una condición clínica caracterizada por hipoperfusión del tejido cerebral y resulta en pérdida neuronal. Numerosas evidencias sugieren que la interacción entre la glia y las células urinarias ejerce los efectos de presión después de un evento isquémico. Con el fin de explorar posibles mecanismos de protección, es importante desarrollar modelos que permitan estudiar las interacciones neurona-glia en un entorno isquémico.
Aquí presentamos un enfoque sencillo para aislar astrocitos y neuronas de la corteza embrionaria de rata, y que mediante el uso de un medio cultural específico permite el establecimiento de culturas neurona o enriquecidas con astrocitos o cultivos neo-glia con alto rendimiento y reproducibilidad. Para estudiar la conversación cruzada entre astrocitos y neuronas, proponemos un enfoque, basado en un sistema de co-cultivo, en el que las neuronas cultivadas en los resbalones de cubierta se mantienen en contacto con una monocapa de astrocitos chapadas en placas multi-pozo. Las dos culturas son mantenidas una parte por pequeñas esferas de parafina.
Este enfoque permite la manipulación independiente y la aplicación de un tratamiento específico a cada tipo de célula, lo que representa una ventaja en muchos estudios. Para simular lo que ocurre durante un accidente cerebrovascular isquémico, los cultivos se someten a un protocolo de privación de oxígeno y glucosa. Este protocolo representa una herramienta útil para estudiar el papel de las interacciones neurona-glia en el accidente cerebrovascular isquémico.
Comience con aislamiento de corteza embrionaria de rata. Los embriones se obtuvieron de una familia de ratas a los 15 días de gestación y se colocan en un tubo estéril De Falcon que contiene PBS. Todavía dentro de los embriones de yema se colocan dentro de un plato de petri que contiene PBS frío.
Con la ayuda de tijeras y pinzas, el saco de yema se rompe, y el embrión se retira y se coloca en otro plato de petri que contiene PBS frío sobre una bolsa de hielo. Es necesario tener mucho cuidado al romper el saco de yema para no dañar el embrión. Coloque el embrión bajo un microscopio diseccionador, fije suavemente el embrión usando un twizzer.
La incisión inicial debe ser paralela a la corteza. Tenga cuidado de no decapitar al animal. El cuero cabelludo y se retiran cuidadosamente para no dañar el tejido cerebral cortical.
Esta siguiente incisión separa la corteza. Retire los vasos sanguíneos presentes en el tejido. Por último, con una pipeta, transfiera el tejido cortical a un tubo Falcon con PBS.
La suspensión de una sola célula se obtiene a través de la digestión mecánica del tejido cerebral cortical utilizando puntas con diámetro decreciente. Asegúrese de que el tejido esté bien homogeneizado Después de la digestión, centrifugar el material a 400 Gs durante tres minutos. Desechar el sobrenadante, y resuspender el sedimento en medio de cultivo, previamente calentado a 37 grados.
Calcular el número total de células presentes en la suspensión utilizando una cámara Neubauer y preparar la dilución para la densidad celular adecuada. Finalmente, sembrar las células en el multi-pozo e incubar a 37 grados. Para preparar el material para el sistema de cultivo conjunta, calentar la parafina en un bloque de calentamiento hasta que se vuelva líquido.
Luego, con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio estéreo, prepara pequeñas esferas sobre los resbalones de la cubierta que anteriormente se colocaban en un pozo múltiple, y recubiertas con Poli-D-Lisina. 24 horas antes de que las dos culturas entren en contacto, cambie el medio de cultivo de las neuronas y astrocitos para complementarlo NBM con o sin calor inactivado FBS. Cuando los dos cultivos estén listos para usar, transfiera la neurona, sentada en los resbalones de cubierta con esferas de parafina a pozos que contienen astrocitos usando una pinza previamente sumergida en 70%etanol.
Después de colocar ambos tipos de células en contacto, espere de ocho a 12 horas y, a continuación, inicie los diferentes estímulos y procedimientos. La privación de oxígeno y glucosa se realiza en un cultivo con siete días de crecimiento. Retire el medio de cultivo y lave las células dos veces con el medio HBSS sin suplementos de glucosa.
Asegúrese de que todo el medio que contiene glucosa está lavado. Selle la Cámara de Hipoxia y añada la mezcla de gas que contiene 95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono durante cuatro minutos con un flujo de 20 litros durante minutos para reemplazar el oxígeno presente en el interior de la cámara. Luego, detenga el flujo y coloque la Cámara de Hipoxia en una incubadora a 37 grados.
Después del período de privación de oxígeno y glucosa, reemplace el medio, HBSS sin suplementos de glucosa con el medio de cultivo adecuado para los procedimientos restantes e incubar las células a 37 grados. Con el fin de caracterizar el tipo de cultivo cortical, realizamos inmunohistoquímica en los tres tipos de cultivos corticales para evaluar el número de células que expresaron GFPA o MAP2, que son marcadores ampliamente utilizados para células astrocíticas y neuronales respectivamente. Este análisis reveló que cuando este protocolo, pudimos obtener un cultivo enriquecido puro de astrocitos con alrededor del 97% de las células que expresaban GFAP.
En cuanto al cultivo enriquecido con neuronas, verificamos alrededor del 78% de las células que expresan MAP2. Sin embargo, identificamos alrededor del 18% de las células negativas GFAP y MAP2. Para el cultivo cortical neurona-glia, Se observó que alrededor del 49% de las células son MAP2 positivo.
31%son GFAP positivos. Y el 20% no son responsables de GFAP ni MAP2. Siete días después del establecimiento de cultivos corticales, el cultivo de la neurona-glia y el cultivo enriquecido con neuronas fueron sometidos a un procedimiento OGD durante 4 y 6 horas.
Después de este procedimiento, las células fueron etiquetadas con MAP2 y luego el número de células positivas MAP2 se cuantificaron mediante microscopía de fluorescencia. En el cultivo de neurona-glia, se observó una disminución de aproximadamente 30%en el número de las neuronas, cuando el cultivo fue sometido a un período OGD de 4 horas. Después de un período OGD de 6 horas, la extensión de la lesión aumenta, alcanzando alrededor del 60% de la pérdida neuronal.
En cuanto al cultivo enriquecido de las neuronas expuestas a OGD, se observó alrededor de 41%y 64%disminución en el número de células MAP2. Por otra parte, se observó que en el cultivo enriquecido con neuronas, hubo un ligero aumento en la extensión de la lesión en comparación con el cultivo de la neurona-glia también expuesto a OGD durante 4 horas. En conclusión, aquí se representa un modelo in vitro para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico establecido de una manera simple, rápida, rápida y costosa y reproducible.
Además, el método descrito también permite implementar neuronas y cultivos primarios enriquecidos con astrocitos, pero también un cultivo de neurona-glia. Por lo tanto, proporcionando un gran modelo in vitro para modelar varias enfermedades cerebrales con un mayor nivel de complejidad, que las líneas celulares inmortalizadas y los cultivos neuronales o gliales puros.
