Los autores desean agradecer a Dana Kamalidenova, Autexier Morgan, y Chopier Roch, quien hizo el video y animaciones, así como Florian Beck para las fotografías y la post-producción del video voz en off. Este trabajo ha sido patrocinado por Olympus y apoyado por becas de la HFSPO (Premio de desarrollo profesional), ANR (Programa Jóvenes y el Programa chercheurs Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), el INSERM y La Pitié Salpêtrière hospital (investigación traslacional contrato) a NR, del Ministerio francés de Investigación y Deutsche Forschungsgemeinschaft becas postdoctorales para arriba, y de las escuelas de doctorado &quot;Fronteras de la Ciencia de la Vida&quot;, Universidad Paris Diderot, Bettencourt Schuller fundación, y FRM (Fondation pour la Recherche Medicale) de becas de doctorado para JS

1. Preparación del líquido cefalorraquídeo artificial y la solución intracelular <ol><li> Antes de iniciar el experimento, se necesita para preparar la solución interna para las grabaciones de patch clamp, así como el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para la preparación hipocampo. Usted, además, necesitará un kit de disección quirúrgica que consiste en tijera y fina tijera iris, dos espátulas y pinzas (herramientas de Bellas ciencia), un dispositivo de gasificación de vidrio (micro-filtro de vela, ROBU Alemania) y la rejilla de tejido (mosquitero o nylon apretado), así como superglue (Dent Uhu). La configuración de la configuración de parche electrofisiología rebanada fue descrito por Finkel y Bookman, 2001 1. </li><li> Para la solución interna, disolver (en mM): 105 K-gluconato, 30 KCl, 10 HEPES y EGTA 0,3 en agua desionizada (en el 70-80% del volumen final). Enfriar la solución a 4 ° C y se añade (en mM): 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris y fosfocreatina 10. Ajustar el pH a 7,4 con KOH y u rellenop con agua desionizada hasta el volumen final. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtrar esta solución (tamaño de poro de 0,2 micras). Alícuotas solución es estable durante 3-4 semanas a - 20 ° C. Por un día experimental, ~ 1 ml de solución interna que se necesita. </li><li> A menos que se indique lo contrario, la ACSF utilizado para la preparación hipocampo y grabaciones de células en la región CA1, contiene (en mM): 119 NaCl, KCl 2,5, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 y 11 glucosa. Disolver estas sales en agua desionizada (~ Osmolaridad 320 mOsm) y solución de este compuesto oxigenado durante al menos 10 min (pH ~ 7,3 a 7,4) con carbógeno (95% O 2 y 5% de CO 2). Preparar al menos 1 litro de solución por cada experimento. En particular debe ser tomado para la preparación de tejido de hipocampo que se utilizará para llevar a cabo experimentos en la región CA3 del hipocampo. En efecto, esta región es propensa a la actividad epileptiforme y la muerte neuronal posterior. Así SYNAPTactividad IC debe ser fuertemente reducido durante la preparación rebanada, y esto se logra mediante la realización de la disección hipocampo en helado de solución de sacarosa que contenía (en mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 glucosa y sacarosa 75. En esta solución, la combinación de bajo contenido de sodio, de calcio y altas concentraciones de magnesio reducir masivamente cocción presináptica y la probabilidad de liberación, así como la actividad postsináptica del receptor de NMDA, minimizando así la actividad espontánea y la muerte celular. Una vez preparadas, las rebanadas de hipocampo utilizados para las grabaciones de las células de la región CA3 son perfundidos con ACSF modificado, que contiene 4 mM CaCl 2 y 4 MgSO 4, para minimizar la actividad polisináptico. </li></ol> 2. Preparación aguda corte del hipocampo <ol><li> Enfriar ~ 300 ml de ACSF para la cámara de corte, así como la preparación, a 4 ° C, mientras que constantemente oxigenar concarbógeno. Preparar un vaso de precipitados pequeño con ACSF a temperatura ambiente (RT) para el almacenamiento de rebanada, que también se oxigenada con carbógeno (Figura Esquema 1). </li><li> Se anestesia el ratón bajo una campana con una toalla de papel empapada con isoflurano pequeño de 1 ml que se añade en la jaula. </li><li> Después de que el ratón esté profundamente anestesiado, le cortaron la cabeza y agrégalo directamente en un plato pequeño con helado de ACSF oxigenada. Eliminar el cuero cabelludo con una tijera pequeña y transferir la cabeza sobre el tejido para las etapas siguientes. Iniciar para diseccionar el hipocampo, como se ilustra y describe en la figura 1. </li><li> Cortar 300-400 micras transversales rodajas gruesas a baja velocidad (3 m / seg) y la frecuencia de vibración de 70 Hz en el frío hielo oxigenada ACSF y transferirlos a una cámara de almacenamiento. Dejar reposar a temperatura ambiente rebanadas durante al menos 1 hora antes de la grabación. De segmentos para los experimentos CA3 se almacenan 25 min a 34 ° C y al menos 30 min a TA, para recuperarse del proceso de corte. </li></ol&gt; 3. Grabación Dual de astroglial evocó corrientes y potenciales neuronales de campo Se describen cómo grabar sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial es decir, las respuestas inducidas por la activación de las sinapsis a través de la estimulación aferencia usando un electrodo extracelular. <ol><li> Constantemente perfundir la cámara de registro con ACSF oxigenada (1.5-2 ml / min, RT), que contiene 100 mM picrotoxina (GABA Un antagonista) para aislar respuestas excitadoras. Transferir una rebanada en una poli-L-lisina (1,5 a 3 mg / ml) cubreobjetos recubiertos, empapar el líquido para conseguir una adhesión buena rebanada y añadir una gota de ASCF en la parte superior de la rebanada. Colocar el cubreobjetos en la cámara de registro. El bloqueo de la transmisión inhibitoria por picrotoxina puede resultar en actividad epileptiforme, es decir espontánea, disparo sincrónico de poblaciones neuronales, que distorsiona la medición de los eventos evocados. Por lo tanto, para prevenir la actividad epileptiforme, hacer unacorte plano (sólo la superficie) entre las regiones CA1 y CA3 para prevenir la propagación a través de la colaterales Schaffer (como se indica en la Figura 2a). </li><li> Estrato radiatum astrocitos pueden ser identificados por su tamaño soma pequeño (~ 10 m) y del proceso de montaje estrellado. Elija una célula al menos 20-30 micras por debajo de la superficie de loncha. Montar un electrodo de estimulación de vidrio (resistencia punta ~ 1 MW) en el alambre de plata que está conectado a la caja de aislamiento de estímulos y conectado a tierra para el baño (simplemente envolviendo el alambre de plata alrededor de la segunda pipeta de vidrio). Colocar el electrodo de estimulación en la región colateral Schaffer, como se indica en la Figura 2A, a una distancia de 200-300 m de distancia del astrocito elegido. Montar el electrodo de registro de campo (~ 2-5 mW) sobre un cable de plata clorada conectado a la headstage del amplificador. Ambos electrodos se llena antes con ACSF. Elija el modo en MultiClamp I = 0, que desactiva com externocomando de entrada y colocar el electrodo de ~ 50 m de distancia del astrocito en la región estrato radiado (Figura 2A). Registrar las respuestas con ganancia de 2 a 10 y con un filtro de 2 kHz del filtro de Bessel. Inyección de corriente eléctrica en el cerebro rebanada desencadena potenciales de acción en los axones colaterales que rodean Schaffer y la liberación posterior del transmisor en las terminales presinápticas que se proyectan hacia postsinápticos neuronas piramidales CA1. Los transmisores liberados provocará un flujo de carga positiva en las células a través de receptores ionotrópicos postsinápticos, que es mensurable extracelularmente como un potencial negativo pequeño. Este campo potencial postsináptico excitatorio (fEPSP) integra la actividad de un grupo de neuronas activas simultáneamente, mientras que la transmisión inhibidora se bloquea farmacológicamente. Aplicar algunos pulsos de prueba (0,1 mseg de duración) para evocar una fEPSP, algunos reposicionamiento del electrodo de estimulación podría ayudar a aumentar la fEPSP. Un típico CA1 estrato radiatum fEPSP se ilustra en la Figura 2B. Detalles adicionales sobre el posicionamiento y formas de onda de respuesta se puede encontrar en Yuan et al. 2003 2. La amplitud fEPSP en una rebanada hipocampo saludable por lo general debe ser más de dos veces mayor que la amplitud de la volea de fibra. Para la cuantificación exacta de la amplitud fEPSP o pendiente, la reponse evocada debería ser monosináptico, como actividad polisináptico (detectable como una respuesta multi-pico) indica la actividad sináptica independiente de la estimulación eléctrica, que podría ser una señal para hiperexcitabilidad. Para los experimentos realizados en la región CA3 del hipocampo, la estimulación y pipetas de registro se colocan como se ilustra en la Figura 3C. Para identificar claramente los insumos musgo de fibra, que son fuertemente facilitadores, dos a dos pulsos de estimulación (50 mseg intervalo entre impulsos) y 1 Hz de estimulación durante unos segundos se aplican para mejorar enormemente la amplitud inicialmente bajo evocado fEPSP responses.At finaldel experimento, DCGIV, un antagonista del receptor mGluR2 / 3, se puede lavar para verificar además que las entradas de fibras musgosas de hecho fueron estimuladas. La aplicación de este antagonista debe disminuir la fEPSP por ~ 90% debido a la alta expresión de mGluR2 / 3 receptores, inhibiendo la liberación presináptica de boutons fibras musgosas. </li><li> Llenar una pipeta de parche (~ 2-5 mW) con solución filtrada interna y montarlo sobre un cable de plata clorada conectado a la headstage segundo, aplicar presión positiva con una jeringuilla, que está conectado mediante un tubo a su soporte de pipetas. Constantemente aplicar un pulso de 20 mseg de prueba de 10 mV y mover la pipeta en el tejido hasta llegar a la superficie de la célula y una flexión en la membrana se vuelve visible. El cero de la pipeta de desplazamiento, eliminar la presión positiva, y la abrazadera de la membrana a - 80 mV. Espere hasta que gigaseal (al menos 1 GΩ) se alcanza (no debería llevar más de unos segundos). Aplicación suave de una cierta presión negativa podría ayudar a alcanzar agigaseal. Romper en la célula se consigue mediante una aplicación breve de presión negativa o el uso de la función múltiple de zap en. Inicie la grabación simultánea de la garantía Schaffer evocado fEPSP y la respuesta astroglial en la abrazadera de tensión (Vhold - 80 mV, frecuencia 0,1 Hz ganancia, filtro de Bessel 2 kHz, 10). La respuesta actual astroglial es bifásica: en primer lugar, verá una rápida corriente transitoria de salida, lo que refleja fEPSPs adyacentes generados por las células piramidales. Esto es seguido por un lento aumento y la decadencia de corriente de entrada (segundos persisten varios (&gt; 10 segundos) después de la terminación de las respuestas neuronales). Esta corriente se debe principalmente a la entrada de potasio en astrocitos, después de la liberación por circundante despolarizadas terminales postsinápticos. Una vez activado transportador de glutamato rápida corriente transitoria (GLT), desencadenada por la liberación de glutamato presináptico está enmascarada por la corriente de potasio. El potencial de mantenimiento de la astrocitos, así como la resistencia de acceso del parche debe ser monitored durante todo el experimento y no debe variar más de ~ 20%, para evitar el control incorrecto de reponses astrogliales debido a cambios en las condiciones de grabación. Astrocitos sólo con un potencial de retención inicial&gt; -70 mV debe ser investigado para estudiar las células sanas. </li><li> Cambie de voltaje a corriente-clamp con el fin de registrar la despolarización de membrana evocado los astrocitos. Aislar el transportador de glutamato glial (GLT) actual por perfusión del ácido glutamato ionotrópicos bloqueador del receptor de quinurénico (5 mM), hasta que el fEPSP está totalmente bloqueado y la amplitud GLT ha alcanzado una meseta. Para identificar claramente la LGT actual, aplicar el antagonista específico de DL-treo-β-Benzyloxyaspartatic ácido (DL-TBOA, 200 mM). Incrementar la fuerza estimulación por 2-veces a 5-veces para registrar las respuestas neuronales y astroglial en la fuerza sináptica diferente, y se aplican dos estímulos estrechamente espaciados (50 mseg intervalo) para investigar las respuestas a la estimulación de pulso pareado. Estabilidad de la serie resistencia y potencial de membrana de la célula glial debe ser supervisada durante la grabación. </li><li> Para visualizar la extensión de la brecha de unión mediada redes astrogliales, acoplamiento de colorante experimentos deben realizarse en el modo de abrazadera de corriente, sin ninguna inyección de corriente, para permitir la difusión pasiva de baja tintes molecular (&lt;1,5 kDa), tales como sulforhodamina-B, a través de los canales de salida brecha. Para minimizar el derrame colorante en el tejido circundante, la presión positiva se debe aplicar a través de la pipeta de parche sólo al entrar en el tejido y el parche debe ser alcanzado tan pronto como sea posible. </li></ol>

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	<li>Finkel, A., Bookman, R., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6+The+electrophysiology+setup.">Chapter 6 The electrophysiology setup.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Yuan, Y. A., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elelctrophysiological+studies+of+neurotoxicants+on+central+synaptic+transmission+in+acutely+isolated+brain+slices.">Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2003).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. 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No hay conflictos de interés declarado.

Grabación dual de sinápticamente indujo respuestas neuronales y gliales es un método útil para estudiar las alteraciones en línea en las actividades de pre-y postsinápticos asociados a cambios en las propiedades astrogliales. La despolarización evocada sinápticamente membrana glial es una medida directa del aumento de potasio extracelular 8, debido en parte a la cocción presináptica potencial de acción, pero sobre todo a la despolarización postsináptica 7. Por lo tanto grabaciones de gliales dinámica del potencial de membrana se puede utilizar para investigar modificaciones en la excitabilidad presináptico, actividad postsináptica, volumen de espacio extracelular y la capacidad de tamponamiento de potasio 6, 8. La corriente transportador de glutamato astroglial es una medida sensible de la liberación de glutamato presináptico, capaz de monitorear cambios a corto plazo en la probabilidad de liberación 3, 5, 9. Además, puede ser utilizado para caracterizar las sinapsis funcionales glia-interacciones en las sinapsis diferentes o en st desarrollo diferentemayores de 10 años. Se debe destacar que GLTs son altamente sensibles a la temperatura 11 y son accionados por el gradiente electroquímico de Na +, K + y H +12. Así, la amplitud y cinética de la corriente GLT depende altamente de las condiciones experimentales elegidas. Además, el curso de tiempo real de aclaramiento de glutamato astroglial derivada de la corriente GLT grabada se sabe que está parcialmente oculta. Esto se debe a que el filtrado de las corrientes de GLT por factores tales como las propiedades electrotonic de astrocitos o la liberación del transmisor asíncrono, que distorsionan sus cinéticas 13. Métodos de extracción de las características temporales de los mecanismos de filtrado se han desarrollado y se pueden utilizar para derivar la distancia real de glutamato curso temporal en situaciones fisiológicas o patológicas, como recenly realiza 6,13,14. Además, la grabación simultánea de la despolarización de la membrana astroglial, en la pinza de corriente, puede proporcionar INSIGhts a posibles alteraciones del potasio extracelular transitorios. Astrocitos individuales contacto de hasta 100.000 sinapsis de ~ 100 neuronas diferentes, y por lo tanto se integran y modular la actividad de redes neuronales locales. Cuando se utiliza la técnica que aquí se presentan, es decir, registro electrofisiológico de células enteras respuestas de los astrocitos para obtener información sobre la actividad sináptica basal, hay que tener en cuenta que en los astrocitos, patch-clamp grabaciones a nivel soma permitir la detección de corrientes en su mayoría procedentes del soma celular o procesos proximales. De hecho, las corrientes detectadas en el soma sólo parcialmente se originan a partir de finos procesos distales cuando una fuerte activación de receptores y canales que ocurren en múltiples procesos finos puede generar corrientes se propagan hacia el soma celular. Así receptor basal y la actividad del canal en los procesos individuales de pequeños compartimentos que cubren astrogliales sinápticas es difícilmente detectable. Esto es debido en parte a la limitada semillaial de control y temporal de las corrientes y tensiones de la membrana de células enteras patch-clamp grabaciones de los astrocitos in situ. Sin embargo, hay que señalar que la superficie de los abundantes procesos astrocíticos diminutas excede con mucho el área de la membrana de los procesos de soma y principal. Además, estos microdominios astrogliales perisynaptic contienen los receptores funcionalmente relevantes y los canales, los cuales probablemente juegan un papel importante en la comunicación neuroglial y regulación sináptica. La técnica que se presenta aquí es por lo tanto sobre todo útil para estudiar la integración astrocytic de actividad sincrónica de conjuntos neuronales, que se producen en particular durante la estimulación aferencia. No debe ser utilizado para estudiar el diálogo entre las sinapsis individuales y adyacentes procesos astrocíticos finas que se producen durante la actividad espontánea basal. Un método alternativo para estudiar las respuestas locales astrogliales inducida por la actividad sináptica basal sería realizar patch-clamp grabaciones de procesos finos, como duno en dendritas 15. Aunque estos procesos astrogliales parches finos es probablemente un reto debido a su pequeño tamaño, es probable que sea una vía que debe seguirse para desentrañar diálogo más estrecho entre microdominios astrogliales y sinapsis individuales. Sin embargo, las probabilidades pequeñas respuestas electrofisiológicas astrogliales resultantes de los procesos individuales de astrogliales finas pueden estar por debajo del umbral de detección, ya que el ruido eléctrico alcanza en promedio 5.3 pA en patch-clamp grabaciones. Otro método para estudiar las respuestas astrogliales a la actividad sináptica es imagen de calcio, ya que la activación de receptores de membrana astrocíticos o transportadores de sustancias neuroactivas puede desencadenar los transitorios de calcio intracelular. Sin embargo, la carga masiva de los astrocitos con indicadores de calcio también puede reflejar principalmente la actividad somática 16. La combinación de imágenes de electrofisiología y calcio también permite detectar pequeñas señales de calcio a partir de los procesos de astrogliales finas, ya sea de forma espontánea o disparada by un mínimo de estimulación sináptica 17, 18. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la alta afinidad indicadores calcio podrían actuar como amortiguadores de calcio, inhibidores de las vías de señalización importantes de calcio, mientras que la baja afinidad indicadores pueden trabajar por debajo del nivel de detección. Finalmente, una técnica elegante y no invasivo para estudiar eventos de calcio en finas procesos astrocíticos, que también evita el lavado de moléculas de señalización intracelular durante su conjunto de células patch-clamp, consiste en utilizar una membrana dirigida sensor de calcio, que puede expresarse en astrocitos in situ, así como in vivo 19. Sin embargo, imágenes de calcio sólo puede proporcionar información acerca de molécula de señalización uno, que está implicado en muchas, pero no todas las actividades celulares, mientras que su conjunto de células patch-clamp proporciona información cuantitativa acerca de todas las diferentes corrientes iónicas activadas en canal y activación del receptor. Por lo tanto, los registros electrofisiológicos simultáneas de neuronas y astrocitosson un método único y de gran alcance para desentrañar la dinámica de la línea de señalización neuroglial iónico y su procesamiento cerebral papel de información.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Picrotoxin </td><td> Sigma </td><td> P1675 </td><td> se disuelven en DMSO </td></tr><tr><td> Ácido quinurénico </td><td> Tocris </td><td> 0223 </td><td> se disuelven a 34 ° C bajo agitación o sonicación </td></tr><tr><td> DL-TBOA </td><td> Tocris </td><td> 1223 </td><td> DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices

Los astrocitos forman junto con las sinapsis neuronas tripartitos, donde se integran y modulan la actividad neuronal. De hecho, los astrocitos detectar entradas neuronales a través de la activación de los canales iónicos y receptores de neurotransmisores y procesar información, en parte, a través de la actividad dependiente de la liberación de gliotransmitters. Además, los astrocitos constituyen el sistema de captación principal para el glutamato, contribuir a tamponamiento espacial de potasio, así como el aclaramiento de GABA. Estas células tanto, un seguimiento constante de la actividad sináptica y, por lo tanto, son indicadores sensibles de las alteraciones en el glutamato sinápticamente-lanzado, los niveles de GABA y potasio extracelular. Además, las alteraciones en la actividad de captación astroglial o capacidad tampón puede tener efectos graves en las funciones neuronales, y podría pasar por alto la hora de caracterizar situaciones fisiopatológicas o ratones knock-out. Grabación Dual de actividad neuronal y astroglial tanto, es un método importante para estudiar las alteraciones enla fuerza sináptica asociada a los cambios concomitantes en la absorción y la capacidad de tamponamiento astroglial. Aquí se describe cómo preparar cortes de hipocampo, la forma de identificar estrato astrocitos radiatum, y cómo registrar las respuestas electrofisiológicas simultáneamente neuronal y astroglial. Por otra parte, se describe cómo aislar las corrientes farmacológicamente sinápticamente evocados astroglial.

Un representante grabación simultánea de sinápticamente respuestas evocadas astrogliales y neuronal (fEPSPs) en el área CA1 del hipocampo se muestra en la Figura 2 AB. La corriente evocada astroglial es bifásica, es decir, que se compone de una corriente transitoria hacia el exterior y hacia el interior una corriente lenta decadencia (&gt; 10 seg) (Figura 2B). La corriente externa refleja la fEPSP evocado, y se bloquea después de la inhibición de los receptores ionotrópicos de glutamato por el ácido quinurénico (traza gris oscuro, Figura 2B) 3. La mayoría de la corriente de entrada lenta refleja la entrada de potasio en el astrocito despolarización postsináptica siguiente, puesto que también se suprimió por el ácido quinurénico, que inhibe glutamato ionotrópicos postsinápticos la actividad del receptor (Figura 2B y Figura 2C 1) 3-6, sabe que representan la principal fuente (80%) de la liberación de potasio 7. El restante rápido aumento de unad corriente de entrada en descomposición se inhibe por el antagonista GLT DL-TBOA (gris claro traza, la Figura 2B y Figura 2C 2). Post-hoc de la sustracción de la corriente restante lento en TBOA (gris claro traza) de la corriente en ácido quinurénico (traza gris oscuro) permite el aislamiento del transportador de glutamato astroglial puro actual (trazo negro), como se ilustra en la Figura 2C 2. La persistente corriente lenta descomposición en ácido quinurénico y TBOA (gris claro traza, la Figura 2B y Figura 2C 2) puede ser bloqueado por TTX (datos no mostrados), y refleja muy probablemente la acumulación de K + extracelular liberado durante la cocción presináptica aferente 3. Estimulación moderada único de Schaffer colaterales induce una corriente relativamente grande sinápticamente evocado astroglial en comparación con la despolarización evocada pequeño grabado en la misma célula (Figura 2D). Esto es debido a laresistencia de la membrana bajo de los astrocitos. Grabación de los evocados sinápticamente dinámica astrogliales potencial de membrana, como se ilustra en la Figura 2D, es una medida directa de los niveles extracelulares de potasio locales 8. La normalización de las respuestas evocadas astrogliales a la actividad neuronal subyacente permite la comparación directa de diferentes experimentos, como mostrado recientemente 6. Corrientes astrogliales, además, puede controlar de manera muy fiable alteraciones en la transmisión excitatoria, como la corriente total sinápticamente evocado astroglial sigue linealmente el aumento de la fEPSP (2E Figura). Corrientes astroglial también reflejan a corto plazo plasticidad sináptica, ya que muestran, como las neuronas, a la par de impulsos facilitación (Figura 2F). Emparejado de células enteras de grabación de una célula piramidal CA1 y astrocitos revelan un comportamiento electrofisiológico muy diferente en ambos tipos de células, ya que los potenciales de acción de neuronas de visualización en respuesta a un pulso despolarizante,mientras que el astrocito vecino es silenciosa (Figura 3A-B). Sin embargo, la estimulación moderada del Schaffer colaterales pueden evocar simultáneamente un rápido potencial excitatorio posynaptic en la célula piramidal CA1 y unas corrientes rápidas hacia el interior hacia el exterior y lento en el astrocito adyacente (Figura 3B 2). Grabaciones duales de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial también se puede grabar en el área CA3 del hipocampo, como se muestra en la Figura 3C. De hecho, la estimulación única de CA3 fibras musgosas evoca en condiciones basales respuestas neuronales muy pequeños, registrado como fEPSPs locales, asociadas a pequeñas corrientes rápidas hacia el interior hacia el exterior y lento en astrocitos (Figura 3 D 1). En contraste, la estimulación de 1 Hz de CA3 fibras musgosas durante unos segundos fuertemente potencia la fEPSP, mientras que sólo aumenta moderadamente la respuesta astroglial (Figura 3D 2). Figura 1. Hippocampus aislamiento para preparar cortes transversales. Para diseccionar el cerebro, cortar el cráneo a lo largo de la línea media (a). Hacer un corte en el plano coronal del bulbo olfatorio (b) y posteriormente a nivel del cerebelo (c). Retire con cuidado el cráneo con la ayuda de una pinza (d), separar los dos hemisferios con una cuchilla (e), y transferirlos en una cuchara pequeña en frío oxigenada ACSF (f). Después de la equilibración ~ 5 min, colocar un hemisferio en el tejido seco con la superficie medial hasta (g). Con la ayuda de dos cucharas eliminar el diencéfalo (hj). El hipocampo es ahora visible, como se ilustra por las líneas de puntos (k). Diseccionar el hipocampo con una cuchara a cabo, a partir de la fimbria, visible como estructura blanco (lm). Transferir el hipocampo de nuevo en la ACSF frío. Prepare un pequeño bloque de agarosa, la posición de los hipocampos dos con la cara hacia arriba y el alveus hippocamp ventralnos enfrenta el borde del bloque de agar, y empapar cuidadosamente todo el líquido lejos para permitir un buen agarre a la agar (n). Pegamento el hipocampo unido al bloque de agar sobre la parte ventral (o). <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg"/> Figura 2. Simultáneas respuestas neuronales y astroglial evocados-sinápticamente en el área CA1 del hipocampo. A) Esquema de la cortes de hipocampo que ilustra la disposición del electrodo de estimulación, para activar el colaterales Schaffer (SC), el electrodo de parche pipeta, para registrar corrientes astrocíticos, y el electrodo extracelular, para grabar fEPSP, evocados por estimulación SC en el hipocampo área CA1. B) rastros representativos de grabaciones simultáneas de fEPSPs (panel superior) y las corrientes astrocíticos (panel inferior) evocada por estimulación sinápticamente-SC en la presence de los medicamentos farmacológicos. Las respuestas se registran primero en la presencia de un bloqueante de los receptores GABA A (picrotoxina, 100 mM, trazas negras) para aislar respuestas excitadoras. La aplicación posterior de un bloqueador de los receptores de glutamato ionotrópicos (ácido quinurénico, 5 mM, huellas oscuras grises), inhibe la fEPSP y la mayor parte de la corriente astroglial de larga duración, desenmascarando un componente transitorio pequeño y rápido de la respuesta actual astrocítico, que es sensible a un bloqueador de transportador de glutamato (TBOA, 200 mM, trazas de color gris claro). Barra de escala, fEPSP 0,1 mV, astrocytic actual 15 pA, 10 ms. C 1). Muestra traza de la corriente de potasio astroglial (1-2), que se puede aislar a partir de la respuesta evocada, que se muestra en B (panel inferior, negro traza), al restar el componente de corriente remanente en ácido quinurénico (2) de la corriente total ( 1). Barra de escala, 20 pA, 1 seg. C 2) La Muestra traza del transportador de glutamato actual (2-3), que se obtiene por sustracción de la i TBOAnsensitive componente lento (3) de la corriente en ácido quinurénico (2). Barra de escala, 2,5 pA, 25 mseg. D) los rastros de ejemplo de una corriente de entrada registrada en fijación de voltaje (panel inferior) y la despolarización de la membrana correspondiente registrado en corriente-clamp (panel superior) inducida en un astrocito por estimulación SC. Barra de escala, la corriente-clamp 1,5 mV, voltaje-clamp 5 pA, 1 seg. E) de entrada-salida curvas que ilustran la relación entre las descargas de fibra presináptica (entrada) y la corriente total astroglial (salida) grabar simultáneamente en respuesta a la estimulación SC (n = 6). Los aumentos astrogliales actuales linealmente con el aumento de descargas de fibra, como la fEPSP neuronal. F) trazas de ejemplo de la respuesta neuronal (fEPSP) y la corriente astrocytic se muestran para la estimulación de pulso pareado en un intervalo de 40 ms entre impulsos. Los sinápticamente evocados exposiciones actuales astrogliales, al igual que las neuronas, dos a dos pulsos de facilitación. Barra de escala, 0,1 mV, 5 pA, 20 ms. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg"/> Figura 3. Grabaciones duales de sinápticamente respuestas inducidas neuronales y astroglial en las zonas CA1 y CA3 del hipocampo. A) Reconstrucción de una célula piramidal CA1 inyectado con sulforhodamina-B (rojo, 0,1%) y un astrocito lleno de fluoresceína dextrano (verde, 0,1%), utilizando el conjunto de células patch-clamp técnica. Barra de escala, a 10 m. B 1) restos representativos de simultáneas de células enteras grabaciones de potenciales de membrana registrados en current-clamp de una célula piramidal CA1 y un astrocito adyacente. El disparo neuronal potencial de acción (negro traza), evocados por inyección de un pA 20 despolarizante impulso de corriente, no evoca respuesta en el astrocito adyacente (gris traza). Barra de escala, 20 mV, 10 pA, 100 mseg. B 2) las huellas de muestra de dos células enteras grabaciones de una célula piramidal CA1 en corriente almejap y un astrocito vecino en fijación de voltaje después de la estimulación SC en presencia de picrotoxina (100 mM). Estimulación SC evoca un potencial postsináptico excitador (EPSP, negro traza), asociado a una corriente astrocytic pequeño y de larga duración-(gris traza). Barra de escala, 5 mV, 10 pA, 100 mseg. C) Esquema de la cortes de hipocampo que representa en el giro dentado (DG) y CA3 áreas la disposición del electrodo de estimulación, para activar las fibras musgosas, el electrodo de parche pipeta (gris), para registrar las corrientes astrocíticas, y el electrodo extracelular, a registro fEPSP, evocada por la estimulación de fibras musgosas CA3. D, E) rastros representativos de grabaciones pareadas del CA3 fEPSPs (paneles superiores, trazas negras en D 1 y D 2) y astrocíticos todo respuestas de las células (paneles inferiores, trazas de grises en D 1 y D 2) a la estimulación única de CA3 mossy fibras en 0,02 Hz (zoom en el recuadro) (D 1) o en una frecuencia de estimulación Hz (D 2). Barra de escala para D <sub&gt; 1 y D-2, 0,2 mV, 15 pA, hora: D 1 1 seg; D 2 100 ms. Recuadro barra de escala, 0,1 mV, 100 ms.

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Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas en<em&gt; Estrato radiado</em&gt; Durante la estimulación de Schaffer colaterales se describe. El aislamiento farmacológico de potasio astroglial y corrientes transportador de glutamato se demuestra.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

dual-electrophysiological-recordings-synaptically-evoked-astroglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.1K vistas.  Collège de France. La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas en Estrato radiado Durante la estimulación de Schaffer colaterales se describe. El aislamiento farmacológico de potasio astroglial y corrientes transportador de glutamato se demuestra.

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

Las grabaciones de doble somáticas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) identificados por la proteína verde fluorescente (GFP) en cortes de hipotálamo

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Investigación

Neurociencias

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Grabaciones electrofisiológicas de potenciales de campo locales y actividad de múltiples unidades de la vía hiperdirecta en ratas anestesiadas

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.