The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Los experimentos con ratones estaban de acuerdo con la Ley Alemana y la Sociedad Alemana para la Neurociencia directrices de la cría de animales. Los comités de cuidado de los animales y la utilización de la Ruhr-Universität Bochum han concedido los permisos apropiados. 1. Preparación y cultivo de astrocitos corticales Nota: Complete estos pasos del protocolo de al menos 7 días antes de proceder a los pasos siguientes, ya que los cultivos de astrocitos deben desarrollar en monocapas confluentes se preparan antes de las neuronas. astrocitos primarios se derivan a partir de cultivos gliales mixtos obtenidos de crías de ratón de todo el día postnatal (P) 0-3. Tres cerebros (6 cortezas) por matraz T75 se van a utilizar. <ol><li> Preparar el medio de astrocitos completándolo medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% v / v de suero de caballo y 0,1% v / v de gentamicina en condiciones estériles. Almacenar el medio a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. </li><li> Escudo 3x T75 frascos wiTH 10 mg / ml de poli-D-lisina (PDL; en el agua de cultivo celular de grado) durante al menos 1 h a 37 ° C en presencia de 6% v / v CO 2. Después del recubrimiento, lavar los frascos dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los cationes no unidos, y añadir 9 ml medio de astrocitos. </li><li> Para la preparación de los cerebros, añadir solución salina equilibrada de 10 ml Hank (HBSS) a 1x 10 cm placa de Petri y 1 ml de HBSS a 1x 15 ml tubo (independientemente del número de los cerebros que se utilizará). Tenga un par de tijeras quirúrgicas, 2 pinzas finas y un binocular a su alcance para el procedimiento. </li><li> Decapitar a 3 crías rápidamente con las tijeras quirúrgicas y recoger las cabezas en un plato vacío de 10 cm. <ol><li> Realizar la preparación de la corteza bajo el binocular. El uso de dos pinzas finas, quitar la piel dorsal del cráneo en la línea media, comenzando desde el cuello hacia el nivel de los ojos. A partir de entonces, el cerebro con sus vasos sanguíneos es visible debajo del cráneo. </li><li>Fijar la cabeza en el extremo rostral con un par de pinzas y una incisión en la línea media del cráneo, comenzando en el extremo posterior. Posteriormente, recortar la derecha y las mitades izquierda del cráneo para exponer el cerebro. </li><li> Cierre la punta del fórceps y posicionarlo ventralmente bajo el cerebro. Levantar el cerebro fuera del cráneo y la transfiere en el HBSS-llenado 10 cm placa de Petri. Proceder de la misma manera con el modelo que faltan para que todos los cerebros se recogen en el plato. </li></ol></li><li> Después de recoger los cerebros, comenzar con la separación de las cortezas pellizcando fuera de la parte posterior del cerebro usando un par de pinzas, como un par de tijeras. Realizar una incisión en la línea media entre los dos hemisferios con un par de fórceps. Fije cuidadosamente el cerebro con una pinza y corte el mesencéfalo y los bulbos olfatorios utilizando un segundo fórceps para terminar con las mitades corticales. </li><li> Fijar la mitad cortical con un par de pinzas y pelar las meninges de los hemisferios por separarlos fesde el borde lateral y posteriormente tirando de ellas desde la superficie cortical utilizando un segundo fórceps. </li><li> Da la vuelta al medio cortical con su superficie orientada hacia el plato; diseccionar cuidadosamente y retire el hipocampo forma de media luna utilizando un par de pinzas. La transferencia de las cortezas individuales en el cónica tubo de 15 ml usando un fórceps cerrados para realizar una corteza individuo. </li><li> Después de recoger todas las cortezas, el tránsito a la campana de flujo laminar estéril y comenzar con los preparativos para la disociación del tejido cortical. </li><li> Añadir 1 ml de DMEM a un tubo de reacción 2 ml y añadir 0,1% w / v de papaína (30 unidades). Incubar la suspensión en un baño de agua a 37 ° C hasta una solución clarificada se desarrolla (aproximadamente 3 min). Añadir 0,24 mg / ml de L-cisteína y 20 mg / ml de DNAsa y agitar suavemente. NOTA: Para la digestión, se necesita aproximadamente 1 ml de solución de enzima. </li><li> Filtro (0,22 micras de tamaño de poro) para obtener 1 ml de solución estéril antes de añadirque en el tejido cortical. Incubar los tubos durante 30 min - 1 h a 37 ° C (es decir, en un baño de agua). NOTA: Los pasos 1.11 a 1.14 son críticos y deberían completarse dentro de 15 min. </li><li> Para terminar la reacción de digestión, añadir 1 ml de medio de astrocitos y se tritura cuidadosamente el tejido digerido usando una pipeta de 1 mL. Para la trituración, mueva suavemente el émbolo de la pipeta, la aspiración y la extrusión de la suspensión de tejido cortical de ese modo. </li><li> Una vez que el tejido ha sido disociado en una suspensión de una sola célula, añadir 5 ml de medio de astrocitos y centrifugar durante 5 min a 216 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente del sedimento resultante y resuspender las células en 1 ml de medio de astrocitos. </li><li> Añadir las suspensiones de células a matraces T75 se repone con 9 ml de medio de astrocitos (véase 1.2). </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en la incubadora en presencia de 6% v / v CO 2. Después de 4 días, lleve a cabo el primer cambio de medio completo (10 ml). A partir de entonces, cambiar el medio de cultivo cada 2 - 3 d. </li><li> Después de 7 días, comprobar si las células han formado una monocapa confluente. Si no es así, esperar otros 2 - 3 días hasta que se alcanza la confluencia completa de la cultura. NOTA: Los astrocitos muestran cuerpos de las células aplanadas grandes, localice en el fondo del matraz y no desarrollan procesos celulares notables. Se diferencian de las pequeñas células progenitoras brillantes de contraste de fase y microglia que residen en la parte superior de la monocapa 17. </li><li> Con el fin de deshacerse de las células progenitoras y obtener un cultivo de astrocitos pura, poner los matraces T75 en un agitador orbital y agitar las culturas O / N a 250 rpm. Asegúrese de que la temperatura se ajusta a 37 ° C y que el filtro del matraz se selló con película de laboratorio para evitar la evaporación del CO 2. </li><li> El día siguiente, aspirar el medio y añadir medio de cultivo fresco de 10 ml rellena con 20 M de citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para Eliminacélulas que se dividen residuales TE. NOTA: la incubación con AraC para 2 - 3 d en la incubadora a 37 ° C, 6% de CO 2 resultará en un cultivo de astrocitos puro. </li><li> Vigilar la pureza de los cultivos de astrocitos mediante inspección visual bajo el microscopio óptico. Si contraste de fase residual brillante células progenitoras y microglia todavía residen en la parte superior de la monocapa de los astrocitos 17 (véase el paso 1.16), repita los pasos 1.18 y 1.19. NOTA: El confluentes y monocapas de astrocitos puros se pueden mantener durante un máximo de 14 días en la incubadora (37 ° C, v 6% v 2 CO /) antes de proceder al siguiente paso. Cambiar la mitad del medio cada 3 d. No se debe recoger, de congelación y descongelación de los astrocitos, ya que estas células pierden sus propiedades neuronales de apoyo a través del procedimiento de almacenamiento. </li></ol> 2. Los astrocitos se preparan para el cocultivo indirecto Nota: 48 - 72 h antes de preparar las neuronas, astrocitos transferencia a la cell-insertos de cultivo. Generalmente, un solo matraz T75 proporciona un número suficiente de células para apoyar los cultivos neuronales obtenidos con un preparado. <ol><li> Colocar tantas como sea necesario insertos en 24 pocillos de placas. Escudo cada inserto con 10 mg / ml PDL (disuelto en agua de cultivo celular de grado) por alrededor de 1 h a 37 ° C, 6% v / v CO 2. Después de la incubación, lavar las piezas de inserción dos veces con PBS. Mientras tanto, proceder a la preparación de los astrocitos. NOTA: Los insertos llenos de PBS se pueden mantener hasta que la suspensión de células de astrocitos está listo para su uso. </li><li> Aspirar el medio de astrocitos (con AraC) y lavar la cultura una vez con 10 ml de PBS para asegurar que se quite cualquier suero residual. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,05% a los matraces y se incuban las células durante tripsinización a 37 ° C, 6% v / v de CO2 durante aproximadamente 10 min. </li><li> Controlar el desprendimiento de las células por inspección visual usando un microscopio y FacilitaTA El desprendimiento de las células tocando el lado de los matraces contra el escritorio. NOTA: Los pasos 2.5 a 2.8 son críticos y deberían ser terminado dentro de 15 - 20 min. </li><li> Después de la tripsinización, suavemente volver a suspender las células en medio de astrocitos 7 ml y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 216 x g. </li><li> aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de astrocitos. </li><li> Contar las células utilizando una cámara de recuento. </li><li> Llene el fondo de los pocillos de la placa de pocillos-24 con 500 l medio de astrocitos y la transferencia de 25.000 células en 500 l medio de astrocitos en cada inserto individual. Incubar el cultivo a 37 ° C, 6% v / v CO 2. NOTA: Tras recorrer 42 - 72 horas los cultivos alcanzarán aproximadamente el 100% de confluencia. En esta etapa la pureza del cultivo puede ser verificada mediante inmunohisto 11. Los cultivos confluentes se pueden mantener durante un máximo de 7 días hasta que proceder a lapróximo paso. Cambiar la mitad del medio cada 3 d. </li></ol> 3. Preparación de las neuronas del hipocampo primaria Nota: las neuronas del hipocampo de ratones primaria deben derivarse de E15.5 - E16 embriones de ratones embarazadas cronometrados. <ol><li> Preparar medio neurona (MEM con piruvato de sodio 10 mM, 0,1% w / v ovoalbúmina, 2% v / v B27 suplemento de medio, y 0,1% v / v de gentamicina (esterilizada por filtración)), y medio de preparación (HBSS con 0,6% w / v de glucosa y 10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-ácido etanosulfónico piperazina)). Pre-calentamiento y pre-equilibrar el medio de neuronas en frascos de filtro a 37 ° C, 6% v / v de CO2. </li><li> Colocar los portaobjetos de vidrio (12 mm de diámetro) en los pocillos de 24 pocillos de placas (utilizar los cubreobjetos especiales, que tienen una muesca para el uso con insertos de cultivo celular). <ol><li> Escudo durante al menos 1 h con 15 mg / ml de poli-DL-ornitina en agua (cultivo celular de grado) a 37 ° C. Use por lo menos 500 l por pocillo para asegurar quelos cubreobjetos están completamente cubiertos. Lavar los pocillos dos veces con PBS. Deje el PBS en los pocillos hasta en placas las células. Asegúrese de que los pozos no se sequen. </li></ol></li><li> Para diseccionar los hipocampos, preparar 3x 10 cm platos llenos con medio de preparación y 1x tubo de 2 ml con 1 ml medio preparación. Preparar tijeras y 2 pinzas finas. </li><li> Sacrificar el ratón embarazadas por dislocación cervical, esterilizar el abdomen mediante lavado con 70% v / v de etanol, y abrir el abdomen con unas tijeras afiladas. Extirpar el útero de cuentas cuidadosamente con unas tijeras y transferir el órgano en 1x 10 cm plato lleno de medio de preparación. </li><li> A continuación, retire los embriones del útero. incisión cuidadosamente el útero y eliminar el amnios sin dañar los embriones mediante el uso de 2 fórceps. A partir de entonces, decapitar cada embrión con un par de tijeras y transferir las cabezas en un segundo plato 10 cm suministrado con medio de preparación. </li><li> Proceder a la preparación de los cabezales (similar a la preparación se describe en 1.4 hasta 1.7). <ol><li> Inmovilizar la cabeza con un par de pinzas y una incisión en el cráneo y la piel en la región del cuello cerca de la parte posterior del cerebro, perpendicular a la neuroeje. Use un segundo par de pinzas para levantar tanto el cráneo y la piel que cubre, y doblar la tapa del cráneo suave hacia el extremo rostral de la cabeza, exponiendo de esta manera el cerebro. </li><li> Con la ayuda de unas pinzas 2, separar el cerebro de la cavidad craneal. Para ello, cerca de 1 par de pinzas y separar el cerebro del cráneo a partir de los bulbos olfatorios y moviéndose hacia la parte posterior del cerebro. Recoge los cerebros en otra placa de 10 cm lleno de medio de preparación. </li></ol></li><li> Diseccionar los hipocampos de los restos de la corteza, como se describe anteriormente para la preparación de astrocitos (paso 1.6). Retire el hipocampo de cada hemisferio y recogerlas en el tubo de 2 ml lleno de medio de preparación. </li><li> Después de completar la disección, transferir el tubo a la cámara de flujo laminar estéril y Digest el tejido del hipocampo con 1 ml solución de digestión que contiene papaína. Preparar la solución de digestión como se describe en el paso 01.09 a 01.10, pero el uso MEM lugar DMEM. NOTA: Los pasos 3.9 a 3.12 son críticos y deben ser completado dentro de los 10 - 15 min. </li><li> Después de la terminación de la digestión, retirar cuidadosamente la solución de digestión por succión suave con una pipeta. </li><li> Lavar los hipocampos 3 veces con medio neuronal añadiendo secuencialmente y posteriormente aspirar cuidadosamente 1 ml de medio de cultivo fresco por ciclo de lavado. No centrifugar la suspensión celular. </li><li> Después de la etapa de lavado final, se tritura cuidadosamente el tejido en 1 ml medio de la neurona. </li><li> Contar las células usando una cámara de recuento y la placa 35.000 células en 500 l de medio neurona por un solo pocillo de una de 24 pocillos de la placa (la placa mencionada en 3.2). NOTA: Opcionalmente, una alícuota de células se puede contratinción con azul de tripán para evaluar la vitalidad de la preparación de células. Controlar la densidad de placas por inspección visualion utilizando el microscopio (típicamente 90 - 110 células por campo visual de un objetivo estándar 10X). </li><li> Colocar las neuronas en la incubadora a 37 ° C, 6% v / v de CO2 durante 1 h. </li><li> Publicar incubación, tomar las inserciones preparados (sembradas con monocapas confluentes de astrocitos) fuera de la incubadora (véase el paso 2.8). Intercambiar el medio por aspiración el medio de astrocitos y reemplazándolo con 500 l de medio fresco neurona. NOTA: Los insertos deben albergar monocapas de astrocitos confluentes después de 2 - 3 Días DIV (in vitro). </li><li> Coloque los insertos con astrocitos cuidadosamente en los pocillos que contienen los cultivos de neuronas (paso 3.13) usando pinzas estériles. </li><li> Coloque el cocultivo neurona-astrocito indirecta resultante de nuevo en la incubadora a 37 ° C, 6% v / v CO 2. NOTA: En estas condiciones, las neuronas pueden ser cultivadas para un máximo de 4 semanas en medio completamente definido. Ningún cambio medio es necesario. Para los cultivos de largo plazo, se recomienda llenar correopozos MPTY con agua estéril con el fin de reducir la evaporación de la placa de pocillos 24. </li><li> Realizar análisis in vitro de células de cultivo después de períodos deseado (por ejemplo, para inmunocitoquímica, PCR, Western blot, los registros electrofisiológicos de pinzamiento zonal (o matriz multielectrodo) 7,15,18). NOTA: El sistema de cultivo también es adecuado para el tratamiento farmacológico agudo y crónico de las culturas 11. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El objetivo principal del protocolo actual consiste en cultivos neuronales y los astrocitos completamente separados, mientras se mantiene en medio compartido. Por esta razón, la pureza de los cultivos obtenidos debe ser verificada en el comienzo del procedimiento. Se recomienda el uso de la tubulina específico de neuronas, o la proteína de neurofilamentos NeuN como marcadores neuronales, GFAP como marcador de los astrocitos, antígeno O4 como marcador precursor de oligodendrocitos y la proteína Iba1 para identificar...

A lo largo de las últimas décadas, la interpretación general de la función neuroglia ha evolucionado a partir de la atribución de un apoyo meramente hacia un papel regulador activo en relación con la función neuronal 1. Debido a su impacto importante en la homeostasis cerebral en salud y enfermedad 2, los astrocitos son de especial interés para la comunidad científica. En los últimos años, una diversidad de estudios se han centrado en las interacciones neurona-glía in vivo e in vitro 3. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de cultivo no permiten el análisis separado de los dos tipos de células y de sus respectivos secretomas. Varios enfoques explotan el cocultivo directo de las neuronas y glía para lograr la supervivencia de larga duración y el desarrollo de la red neuronal fisiológicamente relevante 4-6. El presente protocolo alcanza los mismos objetivos, manteniendo ambos tipos de células separadas físicamente 7. En comparación con conditioned medio se aproxima a 8,9, nuestro sistema permite estudiar la comunicación bidireccional entre neuronas y astrocitos. La expresión de moléculas de señalización secretadas se puede monitorizar mientras que las células maduran en el medio compartido. Esta oportunidad es especialmente relevante, como astrocitos liberan factores solubles, tales como citoquinas, factores de crecimiento y moléculas de matriz extracelular 10,11, regulando de este modo el crecimiento neuronal y la función 7,12. Por lo tanto, se ha demostrado que la adición de trombospondina a las células ganglionares de la retina in vitro induce la formación de sinapsis 13. Sin embargo, otros factores desconocidos son necesarias para hacer sinapsis funcionales 13. Además, las moléculas liberadas por los astrocitos tienen que identificarse con el fin de comprender la base de las interacciones neurona-glía. El cultivo de las neuronas primarias y astrocitos de ratón y de rata se ha descrito previamente 14-16. Aquí nosotrospresentar una herramienta elegante y versátil para combinar ambos tipos de células en un enfoque cocultivo indirecto. Dado que las dos culturas se separan físicamente aún compartiendo el mismo medio, el impacto de las neuronas, astrocitos y las moléculas solubles, pueden ser analizados por separado, creando así una poderosa herramienta para estudios de interacciones neurona-glía.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:115px;">Reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">B27</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">17504-044</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">Cytosine-&#223;-D arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C1768</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317, H361</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DMEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">DNAse</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">LS002007</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G1397</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317-334</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Glucose</td>
			<td style="width:152px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">22700</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HBSS</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">14170-088</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">15630-056</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Horse serum</td>
			<td style="width:152px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:151px;">S9135</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C-2529</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">MEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">31095-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A7641</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H334</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Papain</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">3126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">PBS</td>
			<td style="width:152px;">self-made&#160;</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0899</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P3655</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S8636</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Equipment</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">24 well plates</td>
			<td style="width:152px;">Thermoscientific/Nunc</td>
			<td style="width:151px;">142475</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">24-wells plate (for the&#160; indirect co-culture)</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353504</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Binocular</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">MZ6</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Cell-culture inserts</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353095</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Counting Chamber</td>
			<td style="width:152px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:151px;">650010</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Forceps</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont (#5)</td>
			<td style="width:151px;">11254-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">glass cover slips (12 mm)</td>
			<td style="width:152px;">Carl Roth (Menzel- Gl&#228;ser)</td>
			<td style="width:151px;">P231.1</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Incubator</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Heracell 240i</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Micro tube (2 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">72,691</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">DMIL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Millex Syringe-driven filter unit</td>
			<td style="width:152px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:152px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Innova 4000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Parafilm</td>
			<td style="width:152px;">Bemis</td>
			<td style="width:151px;">PM-996</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Petri dishes (10 cm)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,902</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">pipette (1 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">Pipetman 1000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sterile work bench</td>
			<td style="width:152px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:151px;">Laminar Flow SterilGARD III</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Syringe</td>
			<td style="width:152px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:151px;">9003016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">T75 flask</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,911,002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">tube (15 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">64,554,502</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Water bath</td>
			<td style="width:152px;">GFL</td>
			<td style="width:151px;">Water bath type 1004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

el desarrollo neuronal y la función es el requisito previo del desarrollo como en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la formación altamente controlada y mantenimiento de redes neuronales complejas no se entienden por completo hasta el momento. Las preguntas abiertas relativas a las neuronas en salud y la enfermedad son diversas y que va desde la comprensión del desarrollo de base a la investigación de patologías relacionadas con el hombre, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia. El análisis más detallado de las neuronas se puede realizar in vitro. Sin embargo, las neuronas son células exigentes y necesitan el apoyo adicional de los astrocitos para su supervivencia a largo plazo. Esta heterogeneidad celular está en conflicto con el objetivo de diseccionar el análisis de las neuronas y astrocitos. Presentamos aquí un ensayo de cultivo celular que permite la co-cultivo a largo plazo de las neuronas y astrocitos primarios puros, que comparten el mismo medio químicamente definido, mientras que estar físicamenteapartado. En esta configuración, las culturas sobreviven durante un máximo de cuatro semanas y el ensayo es adecuado para una diversidad de investigaciones relativas a la interacción neurona-glía.

El análisis de los cultivos neuronales a través del sistema de cocultivo indirecto es múltiple y se puede realizar en diferentes etapas de la maduración de la cultura. Debido al hecho de que las células se pueden mantener durante un máximo de 4 semanas, son posibles investigaciones a largo plazo de los cultivos. El esquema en el panel central izquierda de la Figura 1 demuestra la configuración de cocult...

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The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K vistas.  Ruhr-University.  Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia. 

Video: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Observing Virtual Social Interactions

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language affect our decisions in personal and professional life alike 1. These "friend or foe" judgements are often based on first impressions, which in turn may affect our decisions to "approach or avoid". Previous studies investigating the neural correlates of social cognition tended to use static facial stimuli 2. Here, we illustrate an experimental design in which whole-body animated characters were used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) recordings. Fifteen participants were presented with short movie-clips of guest-host interactions in a business setting, while fMRI data were recorded; at the end of each movie, participants also provided ratings of the host behaviour. This design mimics more closely real-life situations, and hence may contribute to better understanding of the neural mechanisms of social interactions in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in social behaviour in such clinical conditions as social anxiety and autism 3.

This article demonstrates an experimental design in which whole-body animated characters are used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) to investigate the neural correlates of observing virtual social interactions.

La investigación del cerebro imágenes de los correlatos neurales de Observación de las interacciones sociales virtuales

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language ...

Investigación

Neurociencias

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

La investigación del cerebro de imagen del efecto de la memoria-Mejora de la emoción

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

La investigación del cerebro de imagen del efecto perjudicial de la emoción sobre la cognición

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

Un ensayo para la permeabilidad del neuroepitelio embrionario de pez cebra

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In Vitro Análisis para el estudio de la agregación de la proteína Tau y detección de drogas

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un

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