Este protocolo permite cuantificar el área, el perímetro y la forma de la estructura intracelular a partir de su imagen bidimensional. Esta técnica es rápida y fácil, solo requiere ajustes de laboratorio estándar y un microscopio confocal y utiliza software de código abierto. Demostrando el procedimiento estará Anna Balcerak, una estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Comience por sembrar cuatro veces 10 a las quintas celdas en 0,5 mililitros de medio de cultivo por pozo en un tobogán de cámara recubierto de colágeno de cuatro pozos para un cultivo de 24 horas en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y cinco grados. A la mañana siguiente, utilice un microscopio invertido óptico para verificar la presencia de al menos un 90% de monocapa confluente y utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de corte Z individuales. Para el análisis de adhesión focal, abra las imágenes en ImageJ y seleccione analizar, establecer escala, eliminar escala y global para establecer la escala de la imagen en píxeles.
Para incluir el nombre de archivo y el área de la región de interés en las opciones de medición, haga clic en analizar y establecer medidas y compruebe el área y las opciones de etiqueta de visualización. Para restar el fondo, seleccione el proceso y reste el fondo. Establezca el radio de la bola rodante en 50 píxeles y compruebe el paraboloides deslizantes.
Para determinar el área de la región de interés más pequeña, esboce la adhesión focal individual más pequeña y haga clic en analizar y medir para medir el área. Cuando se hayan seleccionado y medido al menos 20 regiones de interés, calcule y guarde la media de los resultados obtenidos. Establezca el límite superior en el 25% de un área de celda típica.
Para conferir la imagen a binario, haga clic en imagen, ajuste y umbral, y compruebe el valor predeterminado, blanco y negro y fondo oscuro. Para medir el número y las áreas de las regiones de interés, seleccione analizar y analizar las unidades de partículas y comprobar las unidades de píxeles, mostrar los resultados, borrar resultados y resumir. Transfiera los datos de tamaño medio de sector, recuento y área total de la ventana de resumen al programa de administración de datos de su elección.
Para la cuantificación de la adhesión focal, abra la macro ImageJ de adhesión focal y entre en el área de la región de interés más pequeña como el área del parámetro de región de interés más pequeña. Establezca el valor de tipo de umbral en manual o automático y guarde los cambios. A continuación, llame a la macro desde ImageJ y seleccione la imagen que desea procesar.
Para el análisis manual de formas de celda, abra una imagen en un programa de software de procesamiento de imágenes adecuado y seleccione los parámetros que se van a medir. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para delinear manualmente los bordes celulares como se marca en las proteínas de unión de su elección. Los parámetros elegidos se calcularán automáticamente para cada celda.
Cuando se hayan descrito todas las celdas, seleccione editar, seleccionar y agregar al administrador. Solo se deben seleccionar celdas completamente visibles completas con bordes ininterrumpidos. Para realizar la medición, marque todos los números que aparecen en el cuadro izquierdo de la región del administrador de intereses y haga clic en medir.
Los resultados aparecerán en el cuadro de resultados y se pueden importar a la hoja de cálculo de su elección. El análisis automatizado de células facilita la cuantificación del gran número de células. Para cada nuevo tipo de celda, ejecute primero la macro para establecer parámetros.
Cuando la macro haya terminado, seleccione establecer límites de tamaño de celda. Haga clic en la etiqueta de las celdas más pequeñas y grandes y haga clic en medir. Establezca el valor de la celda más pequeña y las variables de celda más grandes y guarde los cambios.
Cierre todas las ventanas de macro y seleccione la imagen que desea procesar en escala de grises. A continuación, vuelva a ejecutar la macro. La macro proporcionará una tabla de los resultados que incluye el índice de forma de celda, la relación de aspecto y los datos de lista de regiones de interés.
Aquí, se pueden observar imágenes representativas de adhesiones focales con ImageJ, incluidos los contornos numerados finales y las superposiciones de los contornos de adhesión focal con la imagen original para las líneas celulares de control y derribo. Como se ilustra en este análisis, las células de knockdown demostraron un mayor número de adherencias por célula, así como adherencias que son de mayor tamaño en comparación con las celdas de línea celular de control. En estas imágenes, se muestran regiones representativas de monocapas celulares tratadas sin tratar y tratadas quimioteráficas.
Las células de esquema se caracterizaron de acuerdo con sus valores de índice de forma celular, por ejemplo en este análisis que muestra un aumento en el último contenedor y un aplanamiento de los picos principales para las células tratadas con fármacos en comparación con los controles no tratados. A continuación, se podría generar una distribución de frecuencia y una distribución acumulativa para cada cultivo celular. Las imágenes en escala de grises de las monocapas, como se ha demostrado, permitieron el análisis y cuantificación de 512 celdas a partir de 12 campos de visión que revelan una distribución de frecuencia relativa del índice de forma de celda.
Para que este protocolo funcione, es importante utilizar imágenes de la mejor calidad posible. La siembra celular, la tinción y las imágenes adecuadas deben garantizar imágenes de una calidad experimental suficiente.
