Esta investigación fue apoyada por subvenciones del National Defense Medical College y por una beca de investigación de Salud y Ciencias del Trabajo para la investigación sobre enfermedades intratables del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón.

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (nº 16058). Los animales se mantuvieron en la comida de laboratorio estándar (CLEA Japan Inc, Tokio, Japón). Los animales de laboratorio fueron tratados de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Recolección y separación de linfocitos
NOTA: Dado que los linfocitos deben estar frescos y no pueden almacenarse, deben ser recogidos de ratas para cada experimento. Además, los linfocitos trópicos intestinales deben recogerse directamente del conducto torácico donde circulan. Se espera que todos los procedimientos se completen en un plazo de 6 horas, y todos los instrumentos, guantes y superficies estén limpios. Con el fin de mantener a los animales en un estado fisiológicamente estable, todos los salinas y otros fluidos utilizados en el experimento deben mantenerse calientes.
<ol><li>Formar un tubo de canulación (1 mm de diámetro) como una curva de heparina (un radio de unos 5 mm) después de sumergirlo en agua caliente (aproximadamente 80-90 °C) y fijarlo a una placa de plástico utilizando cinta adhesiva durante unas horas de antelación.</li>
	<li>Anestesiar una rata Wistar macho (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y cortar el vello corporal del abdomen usando un cortapelos. Retire el cabello firmemente después de afeitarse para que el cabello no entre en la cavidad abdominal.</li>
	<li>Después de confirmar que la profundidad estable de la anestesia requerida para el procedimiento se obtiene mediante pellizco de dedo del pie, hacer una incisión con tijeras quirúrgicas horizontalmente desde la línea media hasta el área subcostal izquierda. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos en el peritoneo parietal observando los vasos bajo la luz.</li>
	<li>Envuelva el estómago con gasa húmeda y mueva el estómago suavemente hacia la derecha fuera del cuerpo para revelar los órganos retroperitoneales. Inserte una muesca entre los músculos erectores de la columna vertebral y el tejido adiposo usando tijeras quirúrgicas y sepámelas sin rodeos con los dedos.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del conducto torácico. El exceso de tejido conectivo aumenta con la edad. Exponga el conducto torácico desde justo debajo de los crus izquierdos del diafragma caudalmente hasta que se visibilizó una longitud de 20 mm del conducto torácico. Separe suavemente las adherencias entre el conducto torácico y la aorta utilizando pinzas de precisión o hisopos de algodón húmedo.<ol>
<li>Realice este proceso cuidadosamente porque algunas ratas tienen arterias ramificadas de la arteria abdominal cruzando sobre el conducto torácico o un conducto torácico corto debido a una posición más alta del plexo linfático (pequeños conductos torácicos que se propagan como telarañas). Evite el contacto innecesario con el conducto torácico para evitar inducir edema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicar una ligadura por una cuerda (3-0 de seda) en el conducto torácico justo debajo de los crus izquierdos del diafragma. El conducto torácico caudal se distete.</li>
	<li>Hacer un agujero (5 mm de diámetro) en la pared abdominal apuñalando el filo de las tijeras quirúrgicas, pasar el tubo de canulación curvada de horquilla, y ligar el tubo en el músculo iliopsoas en un momento dado. Llene el tubo de canulación con solución salina normal que contenga 10 heparinaS/ml.</li>
	<li>Después de colocar una cuerda (3-0 de seda) debajo del conducto torácico distecido, apuñale el conducto torácico con el borde de corte afilado de un tubo de canulación, lo cannulate hacia la cola de unos 5 mm y ligar el conducto torácico con tubo de canulación para su fijación.</li>
	<li>Para suministrar solución salina para evitar la deshidratación, cree un agujero (3 mm de diámetro) en la pared anterior del átrum del estómago utilizando pinzas de precisión y pase el tubo de silicio (2 mm de diámetro) al duodeno a través del anillo pilórico. Después de coser una herida y mantener a los animales en las jaulas de Bollman, comience a infundir solución salina cargada de azúcar en el duodeno de cada rata desde el tubo de silicio a un caudal de 3 ml/h. Cubra toda la jaula con una toalla de papel para mantenerla caliente.</li>
	<li>Fije el tubo de canulación al agujero en el centro de la tapa de un tubo cónico de 50 ml sobre hielo que contenga 6 heparina U/ml, 10% suero bovino fetal y MEDIO RPMI 1640 (pH 7.4; ver la tabla de materiales) y recoger linfocitos de conducto torácico (TDL) en hielo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con la punta del tubo a la pared del tubo cónico para evitar la oclusión del tubo cannulado debido a la formación de coágulos de fibrina dentro del tubo. El líquido linfático (aproximadamente 20 ml) incluyendo aproximadamente 1.0 x 108~ 109 linfocitos se puede obtener en 6 horas. Para obtener los linfocitos bajo anestesia completa, se controla el plano de anestesia y se observa adecuadamente el flujo linfático. Los mismos anestésicos se añaden a la misma dosis unas 3 horas después de que las ratas son puestas en la jaula de Ballman para obtener anestesia profunda continuamente durante 6 horas.</li>
</ol>2. Etiquetado de linfocitos con éster de diacetato de carboxofluorescetina (CFDSE)
<ol><li>Disolver CFDSE (Tabla de Materiales) en sulfóxido de dimetil (DMSO) a 15,6 mM (500 μg de CFDSE disuelto en 60 μL de DMSO).</li>
	<li>Incubar linfocitos (1 x 108~109)en 50 ml de RPMI 1640 con 50 μL de solución CFDSE durante 30 min a 37 °C como se describió anteriormente10.</li>
</ol>3. Configuración experimental para estudios microvasculares
<ol><li>Ratas receptoras de anestesia (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos. Moje el abdomen antes de acicalar la piel para minimizar la contaminación del cabello. A continuación, abra el abdomen de la rata Wister receptora a través de una incisión de línea media.</li>
	<li>Coloque una rata en una placa portátil de acero inoxidable (aproximadamente 120 x 300 mm) con un agujero rectangular alrededor del centro cubierto con un tobogán de vidrio (24 x 50 mm). Elija unos 10 cm del segmento ileal, incluidos los PPs para la observación.</li>
	<li>Mantenga el intestino lo más caliente posible y húmedo con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) calentada a 37 °C. Remoje la gasa que se utiliza para cubrir el intestino delgado con PBS.</li>
	<li>Mientras que dar anestesia continua con 2 % isoflurano (ver tabla de materiales), poner la diapositiva en el escenario del microscopio y elegir áreas adecuadas para la observación de la microcirculación en PPs donde algunos HEV están corriendo a través de la serosa. Rango de PPs en tamaño; los más grandes son adecuados para la observación de la microcirculación utilizando CLSM. El intestino delgado no es recto en algunos lugares; un segmento recto de al menos 2 cm de largo sin ninguna tensión es adecuado para la observación.</li>
	<li>Cubra el segmento intestinal adyacente y la mesentería con algodón absorbente empapado con PBS. Coloque el segmento intestinal entre dos bolas de algodón enrolladas y colóquelo lo más lejos posible del cuerpo de la rata para evitar que vibre los latidos del corazón y la respiración de la rata.</li>
	<li>Usando una jeringa de 1 ml, inyecte lentamente (más de 1 min) TDL etiquetados con CFSE (1 x 108 células) en la vena yugular de las ratas receptoras. Una inyección intravenosa rápida puede influir en la circulación sistémica.</li>
</ol>4. Microcirculación de linfocitos
<ol><li>Supervise continuamente los TDLs en la microvasculatura de los PPs utilizando CLSM y grabe en un ordenador durante 3 horas utilizando fotografías de lapso de tiempo a intervalos de 30 s. La profundidad de la serosa al HEV de los PPs es de aproximadamente 25 μm, lo que permite la observación de los vasos linfáticos estroboscópicos y capilares a una profundidad de 30 μm.</li>
	<li>Inyectar Texas Red-dextran (25 mg/kg) en la vena yugular de cada rata receptora para manchar el torrente sanguíneo y Hoechest 33342 (5 mg/kg) para manchar los núcleos celulares.</li>
	<li>(Opcional) Para cuantificar la dinámica de los linfocitos, defina los linfocitos que se adhieren a los HEV durante más de 30 segundos como "linfocitos adhesivos" y linfocitos que emigran de hevs a estroboscómicos como "linfocitos migratorios". A continuación, calcule el porcentaje medio de migración (linfocitos migratorios / linfocitos adhesivos + linfocitos migratorios) por campo de visión (aproximadamente 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un protocolo para recolectar linfocitos ingenuas de intestino y trópicos y observar su migración en PPs de ratas. Estos procedimientos pueden revelar cómo los linfocitos se mueven en la microvasculatura de los PPs y permiten comparar visualmente su dinámica bajo una condición normal o medicada. La observación directa de estas dinámicas tiene mucho mérito para obtener una pista de modificación inmunológica por parte de algunos fármacos, aunque el período observacional se limita a sólo unas p...

Los parches de Peyer consisten en cientos de folículos linfoides en la propria lamina del intestino delgado. Los PPs se dividen en folículos, la región interfollicular y los centros germinales ubicados en la parte inferior de los folículos, donde los linfocitos son estimulados por la presentación de antígenos. No hay vasos linfáticos aferentes, y los antígenos invaden la propria lamina del lúmenes intestinales a través de la capa celular epitelial. La región epitelial que cubre folículos linfoides se llama epitelio asociado al folículo, dentro del cual las células M intercaladas especializadas captan antígenos mucosos. Las células M toman antígenos del lado luminal y los antígenos son capturados por células dendríticas y presentados hacia linfocitos ingenuos que fluyen en PPs a través del endotelio de ventules endoteliales altos (HEV)1. Los PPs desempeñan un papel importante en la inmunidad intestinal y están relacionados con la etapa temprana de la inflamación. Muchas interacciones moleculares implican la entrada de linfocitos a órganos linfoides secundarios (SLOs), incluyendo moléculas de adhesión, quimioquinas2,3y esfingosina-1-fosfato4; por lo tanto, hay muchas dianas terapéuticas esperadas. Por lo tanto, observar la dinámica de linfocitos dentro de los PPs nos permite echar un vistazo a la etapa muy temprana de la inflamación y examinar la utilidad de varios fármacos prometedores.
El método aquí se centra en la migración de linfocitos en PPs, que incluye varios procedimientos (cannulación en el conducto torácico5 y recolección de linfocitos y observación a largo plazo después de la inyección en linfocitos recogidos). Dado que estos procedimientos son complejos y era difícil ver exactamente cómo se realizaba cada procedimiento en informes anteriores, mencionamos aquí algunos consejos para lograr una observación exitosa. Por ejemplo, la canulación de los tubos en el conducto torácico fue muy difícil, y la tasa de éxito inicial de la canulación fue inferior al 50%. Sin embargo, mejoramos el método y logramos una tasa de éxito superior al 80%. Mencionamos algunos otros consejos en este manuscrito que son necesarios para la observación exitosa para permitir la evaluación cuantitativa de la migración transendotelial de linfocitos en varias condiciones.
En informes anteriores, era difícil entender los cambios tridimensionales con el tiempo, como la inyección intravenosa de tinta india para manchar la estructura vascular de los PPs6,o el microscopio siendo monofocal7. En los últimos años, un método observacional utilizando algunos animales transgénicos de proteína de fluorescencia fotoconvertible como ratones Kaede han aclarado los movimientos celulares sistemáticos in vivo8. El otro estudio aclaró el apagado independiente CD69 de la salida de linfocitos de PPs9. Utilizamos microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) debido a su alta capacidad analítica. Ahora podemos obtener fácilmente imágenes de alta resolución y utilizarlas para analizar la dinámica de los linfocitos.
En este informe, demostramos una serie de métodos para evaluar la migración de linfocitos en los PPs. En primer lugar, mostramos métodos refinados de canulación de conductos torácicos para recolectar linfocitos. En segundo lugar, mejoramos los métodos de observación de varias maneras para mantener órganos objetivos siempre que sea posible bajo observación microscópica, lo que nos permite obtener imágenes de alta calidad durante 3 horas. En tercer lugar, cuantificamos los movimientos celulares de la migración de linfocitos para evaluar los efectos de algunos medicamentos. Estos protocolos modificados contribuirán al desarrollo de evaluaciones de inmunología mucosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Los linfocitos ingenuos recirculan de la sangre a los tejidos linfoides bajo condición fisiológica y comúnmente se reconoce como un fenómeno importante en la inmunidad intestinal. El estroma de órganos linfoides secundarios, como los parches de Peyer (PPs) o los ganglios linfáticos mesentericos, es donde los linfocitos ingenuos detectan antígenos. Los linfocitos ingenuos circulan a través del torrente sanguíneo para llegar a ventules endoteliales altos, el portal de entrada en PPs. Se estima que algunos inmunomoduladores influyen en la migración de linfocitos, pero la evaluación precisa de la dinámica de microcirculación es muy difícil, y establecer un método para observar la migración de linfocitos in vivo puede contribuir a la clarificación de los mecanismos precisos. Refinamos el método de recolección de linfocitos del conducto linfático y observando la dinámica detallada de los linfocitos trópicos intestinales en los PPs de rata. Elegimos la microscopía de escaneo láser confocal para observar los PPs de rata in vivo y la grabamos usando fotografía de lapso de tiempo. Ahora podemos obtener imágenes claras que puedan contribuir al análisis de la dinámica de los linfocitos.

Recolección de linfocitos de la linfa Para preparar la rata para la canulación del conducto torácico, haga una incisión en el tenso conducto torácico como se muestra en la Figura 1 y luego mantenga a la rata en la jaula de un Bollman como se muestra en la Figura 2.
Cuando los linfocitos están bien recogidos, podemos obtener alrededor de 20 ml/6 h de líquido linfático que contiene aproximadamente 107</s...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K vistas.  National Defense Medical College. Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

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Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Investigación

Medicina

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

Implantación de parches hiPSC derivado de músculo cardiaco después de lesión del miocardio en un modelo del conejillo de Indias

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Una lesión de globo segmentario controlada por presión arterial carótida de rata con aplicación terapéutica periavential

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is currently the only treatment for life-threatening ventricular fibrillation. However, defibrillation may have side-effects, including intolerable pain, tissue damage, and worsening of prognosis, indicating a significant medical need for the development of more gentle cardiac rhythm management strategies. Besides energy-reducing electrical approaches, cardiac optogenetics was introduced as a powerful tool to influence cardiac activity using light-sensitive membrane ion channels and light pulses. In the present study, a robust and valid method for successful photostimulation of Langendorff perfused intact murine hearts will be described based on multi-site pacing applying a 3 x 3 array of micro light-emitting diodes (micro-LED). Simultaneous optical mapping of epicardial membrane voltage waves allows the investigation of the effects of region-specific stimulation and evaluates the newly induced cardiac activity directly on-site. The obtained results show that the efficacy of defibrillation is strongly dependent on the parameters chosen for photostimulation during a cardiac arrhythmia. It will be demonstrated that the illuminated area of the heart plays a crucial role for termination success as well as how the targeted control of cardiac activity during illumination for modifying arrhythmia patterns can be achieved. In summary, this technique provides a possibility to optimize the on-site mechanism manipulation on the way to real-time feedback control of cardiac rhythm and, regarding the region specificity, new approaches in reducing the potential harm to the cardiac system compared to the usage of non-specific electrical shock applications.

This work reports a method for controlling the cardiac rhythm of intact murine hearts of transgenic channelrhodopsin-2 (ChR2) mice using local photostimulation with a micro-LED array and simultaneous optical mapping of epicardial membrane potential.

Manejo avanzado del ritmo cardíaco mediante la aplicación de fotoestimulación optogenética multisitio en corazones murinos

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the external auditory canal, the middle ear, and epitympanon. Such an approach avoids a retroauricular or endaural skin incision; however, working through a narrow space needs angled microsurgical instruments and specific training in otologic surgery. The transcanal approach restricts the working space; however, it offers a binocular microscopic vision into the middle ear without extended skin incisions and thus, reducing post-operative pain and bleeding. In addition, this minimally invasive approach avoids scar tissue complications, hypoesthesia of the auricle, and potential protrusion of the pinna. Despite its numerous advantages, this method is still not routinely performed by otologic surgeons. Since this minimally invasive technique is more challenging, there is a need for extensive training in order for it to be widely adopted by otologic surgeons. This article provides step-by-step surgical instructions for stapes surgery and reports possible indications, pitfalls, and limitations using this microscopic transcanal technique.

This article describes the microscopic transcanal technique for stapes surgery, providing step-by-step surgical instructions for familiarizing surgeons with this approach.

El enfoque microscópico transcanal en la cirugía de estribos revisado

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans amputation, which is a very rare iatrogenic genital injury. Such complication is conventionally treated by simple hemostasis to achieve self-healing, early gross replantation, or delayed plastic surgery. However, these may lead to obvious unfavorable outcomes such as amputated glans loss, necrosis, malformation healing, or urethral orifice stenosis. In the present study, we adopted microscopic replantation as an emergency approach to achieve the precise anastomoses and anatomic reconstruction of penile glans. The goal of this protocol is to present a detailed emergency management strategy with meticulous surgical skills for the penile glans amputation. The postoperative results showed that the original shape of the glans was perfectly restored with satisfactory cosmetic appearance. The micturition function was completely restored to normal without any obvious complications. There was also no significant reduction in the sensation of amputated glans area. Hence, early meticulous microscopic replantation as soon as possible is an ideal emergency management strategy for the penile glans amputation due to circumcision.

The present protocol describes the emergency management of microscopic replantation of penile glans amputation due to circumcision.

Replantación microscópica del glande del pene Amputación por circuncisión

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative asoedema, hematoma, sustaining pain, and seminal tract obstruction in patients who have undertaken nonmicroscopic epididymal cyst resection or epididymal resection. Nonmicroscopic epididymal cyst surgery is suggested for patients with childbirth plans as a precaution. The treatment of male epididymal cysts via microtechnology is obviously a beneficial option; we took the lead in carrying out microscopic epididymal exploration and cyst resection surgery in China. From September 2017 to April 2021, 41 young and middle-aged male patients diagnosed with epididymal cysts underwent microtechnology treatment in a program titled &#34;microscopic epididymal exploration and cystectomy&#34;. The postoperative follow-up lasted for 3-50 months. The results confirmed that, as microscopic manipulation largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis, the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact under the microscope. Bleeding during the operation was significantly reduced (2-3 mL) and wound drainage was not required. According to follow-up data, microscopic treatment significantly reduced the incidence of postoperative scrotal hematoma, edema, and long-term postoperative pain, thereby promising a higher surgical success rate as well as recurrence prevention. Besides, preliminary experience and reflection suggest that microscopic epididymal exploration and cystectomy provide efficient preservation of the epididymal patency through refined treatment, while a better prognosis can be achieved. We recommend that surgery be carried out before the epididymal cyst develops to 0.8 cm in diameter, for fear that a larger epididymal cyst (&#62;0.9 cm in diameter) could cause the complete destruction of all tubules of the ipsilateral epididymis - a more severe case with damage to the testicular output network.

Here, we present a protocol to treat patients diagnosed with an epididymal cyst using microscopic cyst resection. Based on microscopic manipulation, a largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis was obtained, so the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact.

Resección microscópica de quistes para el tratamiento de pacientes diagnosticados con quiste epididimario

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...

Microscopic Electric Rotary Grinding of Plaques Combined with Graft Repair in the Management of Peyronie's Disease

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the dorsal area of the penis. These plaques are the hallmark feature of this condition, resulting in penile curvature, deformity, and painful erections for affected individuals. Although various nonsurgical treatment options exist, their overall effectiveness is limited. As a result, surgical intervention has become the ultimate choice for patients with severe penile curvature deformities and associated erectile dysfunction. Our research team has successfully employed a combined approach involving microscopic electric rotary grinding of the fibrous plaques and the use of tunica vaginalis or bovine pericardium as graft materials for the repairing of the defects of tunica albuginea in the treatment of PD. This approach has consistently yielded highly satisfactory results regarding the restoration of penile shape, with excellent cosmetic results and significantly improved sexual satisfaction. 
This protocol aims to present a comprehensive surgical management strategy utilizing electric rotary grinding of the plaques and repairing the defects of tunica albuginea by using the tunica vaginalis, which represents an optimal surgical strategy for treating PD.

The presented protocol describes a microscopic surgical method for the treatment of Peyronie's disease by using electric rotary grinding of the plaques followed by using the tunica vaginalis or bovine pericardium as a graft for the repairing of the defects of the tunica albuginea.

Molienda rotativa eléctrica microscópica de placas combinada con reparación de injertos en el tratamiento de la enfermedad de Peyronie

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para el estudio de la dinámica gastrointestinal y los efectos de los fármacos sobre la motilidad

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Evaluación in vitro fiable y reproducible del impacto de los fármacos en los tubos intestinales de ratas

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.