Este modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos celulares que implican la patogénesis de la uveítis posterior humana mediada por el sistema inmunitario. La implicación de esta técnica se extiende hacia el estudio traslacional de la uveítis humana en el monitoreo de la eficacia de nuevos fármacos y para proporcionar una visión mecanicista de la progresión química de la enfermedad. La principal ventaja de utilizar este modelo es la fiabilidad de la inducción de la enfermedad y el uso de técnicas endoscópicas no invasivas que nos permiten monitorizar la progresión de la enfermedad.
Aquí describimos cómo inducir la enfermedad y evaluar la patología utilizando varias lecturas Para preparar IRBP 1-20 Adyuvante de Freund completo o CFA, resuspenda una cantidad calculada del péptido en un volumen mínimo de 100% DMSO. Cuando el polvo se haya disuelto completamente, añadir pequeños volúmenes de PBS al tubo hasta llegar al volumen final calculado de PBS según el número de ratones a inyectar utilizando una agitación suave para mezclar la solución. Después de preparar el adyuvante de Freund completo, pipetear suavemente y con frecuencia la solución para formar una víscera y una emulsión distribuida uniformemente mientras agrega la solución peptídica DMSO PBS gota a gota a una proporción de uno a uno a la suspensión.
Para airear las soluciones, utilice una pipeta de 1000 microlitros ajustada a 700 microlitros para pipetear repetidamente la solución hasta que se haya obtenido una emulsión espesa y cremosa. Antes de inyectar la suspensión peptídica, coloque cada ratón para ser inyectado en una jaula separada y use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 23 para administrar intraperitoneal 1,5 microgramos de toxina Bordetella pertussis en 100 microlitros de RPMI 1640 medio suplementado con 1% de suero de ratón a cada animal. Cuando se ha inyectado una solución de toxina pertussis, el ratón debe mantenerse en una posición similar a un scruff y la piel pellizcada para formar una estructura similar a una tienda de campaña en la parte posterior del cuello.
Enhebra la aguja en el espacio entre el dedo y el pulgar, e inyecte 200 microlitros de la emulsión IRBP en la piel de la tienda, manteniendo la presión después de la inyección y girando la cabeza de la aguja para cerrar la piel antes de la retracción. Para puntuar la enfermedad clínica, el día 21 después de la inyección, confirme una falta de respuesta al reflejo pétalo en el péptido anestesiado inyectado en el ratón y sujete al animal en un desaliño. Aplique tópicamente 1% tropicamide y 2% phenylephrine a la córnea de cada ojo inmediatamente después de la inyección.
Cuando las pupilas se hayan dilatado completamente, coloque el ratón sobre una plataforma de microscopio especialmente diseñada. Coloque el microscopio para un acceso completo a la retina. Ajustar el ocular a lo largo del proceso de imagen según sea necesario para ver el disco óptico y la retina y adquirir imágenes de toda el área de la retina, ajustando y cubriendo todas las esquinas de la periferia.
Para medir la fuga de vasos, administre 100 microlitros de fluoresceína al 2% por vía subcutánea en la parte posterior del cuello y reposicione el ratón de tal manera que la retina esté centrada en el centro de la imagen en vivo. Ajuste el fundoscopio a un filtro de excitación de luz azul a 465 a 490 nanómetros antes de adquirir una imagen de cada uno a 1,5 y siete minutos después de la inyección fluorescente. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, administre por vía intraperitoneal un inyectable antisedante para la recuperación y coloque al ratón en una jaula en una estera precalentada con acceso a una dieta húmeda empapada con monitoreo hasta que el ratón recupere la conciencia.
Para la puntuación de la enfermedad clínica de las imágenes, base la evaluación clínica en la gravedad de la inflamación del disco óptico, el manguito de los vasos retinianos, el infiltrado del tejido retiniano y el daño estructural. Puntúe cada uno de estos parámetros en una escala del uno al cinco. El total colectivo es representativo de la enfermedad clínica para todo el ojo con una puntuación máxima de 20 obtenible por ojo.
Después de obtener imágenes del fondo de ojo para el criterio de valoración clínico final del estudio, eutanasia al ratón. Para el análisis histológico, separe los párpados para acceder a todo el ojo, luego coloque pinzas curvas detrás del globo para agarrar el tejido conectivo orbital y el nervio óptico y enuclear el ojo. Coloque el ojo enucleado en uno a cinco mililitros de glutaraldehído al 4% durante un mínimo de 15 minutos antes de transferir el órgano a uno a cinco mililitros de formaldehído al 10% durante al menos 24 horas.
Después de la tinción histológica del tejido, de acuerdo con los protocolos estándar, asignó puntuaciones en una escala de cero a tres basada en el nivel de infiltración de células inmunes y el grado de daño retiniano. Los cambios fundoscópicos se clasifican durante la progresión de la enfermedad como cambios inflamatorios que incluyen tejido retiniano e inflamación vascular y de disco óptico y daño estructural retiniano, además de cambios histológicos basados en células inmunes infiltrantes y deficiencias estructurales. Estos cambios clínicos e histopatológicos se pueden clasificar y calificar para evaluar la progresión de la enfermedad y evaluar la eficacia de la intervención terapéutica.
La fuga vascular es también una característica patológica del modelo y de la uveítis humana. Como se ilustra en este análisis, la fluoresceína se puede utilizar para visualizar la fuga vascular como otra lectura de este modelo. Es esencial que los investigadores se aseguren de que la emulsión se prepare correctamente sin signos de separación entre las soluciones.
Deben mezclarse bien y el producto final debe tener una textura suave. Este procedimiento puede combinarse con otros métodos de administración de fármacos y con citometría para fenotipado infiltrante en poblaciones de células inmunes retinianas.
