Эта модель может быть использована для изучения клеточных механизмов, связанных с патогенезом иммуноопосредованного заднего увеита человека. Значение этого метода распространяется на трансляционное изучение увеита человека в мониторинге эффективности новых лекарств и для обеспечения механистического понимания прогрессирования химического заболевания. Основным преимуществом использования данной модели является надежность индукции заболевания и использование неинвазивных эндоскопических методик, позволяющих контролировать прогрессирование заболевания.
Здесь мы опишем, как вызвать заболевание и оценить патологию с помощью нескольких показаний Для приготовления IRBP 1-20 полного адъюванта Фройнда или CFA, повторного суспендирования расчетного количества пептида в минимальном объеме 100% DMSO. Когда порошок полностью растворится, добавьте небольшие объемы PBS в пробирку до достижения окончательного расчетного объема PBS в соответствии с количеством мышей, которые будут введены с использованием мягкого перемешивания для смешивания раствора. После приготовления полного адъюванта Фройнда аккуратно и часто пипетку вводят раствор с образованием вискому и равномерно распределенной эмульсии, добавляя раствор пептида DMSO PBS по каплям в соотношении один к одному к суспензии.
Для аэрации растворов используйте пипетку объемом 1000 микролитров, установленную на 700 микролитров, чтобы многократно пипетку раствора до получения густой кремообразной эмульсии. Перед инъекцией пептидной суспензии поместите каждую мышь для инъекции в отдельную клетку и используйте шприц в один миллилитр, оснащенный иглой 23 калибра, чтобы внутрибрюшинная доставка 1,5 микрограммов токсина Bordetella pertussis в 100 микролитрах среды RPMI 1640, дополненной 1% сывороткой мыши каждому животному. Когда раствор коклюшного токсина был введен, мышь следует держать в позе, похожей на неряшливость, а кожу зажимать, чтобы сформировать палатку, похожую на структуру на задней части шеи.
Приденьте иглу к пространству между пальцем и большим пальцем и введите 200 микролитров эмульсии IRBP в шатровую кожу, поддерживая давление после инъекции и вращая головку иглы, чтобы закрыть кожу перед втягиванием. Чтобы оценить клиническое заболевание, на 21 день после инъекции подтверждают отсутствие реакции на лепестковый рефлекс у анестезированного пептида, вводимого мышей и удерживают животное в неряшливости. Местно наносить 1% тропикамид и 2% фенилэфрин на роговицу каждого глаза сразу после инъекции.
Когда зрачки полностью расширятся, поместите мышь на специально построенную ступень микроскопа. Расположите микроскоп для полного доступа к сетчатке. Отрегулируйте окуляр на протяжении всего процесса визуализации по мере необходимости, чтобы увидеть оптический диск и сетчатку и получить изображения всей области сетчатки, регулируя и охватывая все углы периферии.
Чтобы измерить утечку сосудов, введите 100 микролитров 2% флуоресцеина подкожно в заднюю часть шеи и переместите мышь так, чтобы сетчатка была в центре середины живого изображения. Установите фандоскоп на фильтр возбуждения синего света на расстоянии от 465 до 490 нанометров, прежде чем получить изображение каждого через 1,5 и семь минут после флуоресцентной инъекции. Когда все изображения будут получены, внутрибрюшинно доставьте инъекцию против седации для восстановления и поместите мышь в клетку на предварительно нагретый коврик с доступом к влажной пропитанной диете с мониторингом до тех пор, пока мышь не придет в сознание.
Для оценки клинических заболеваний на изображениях основывайте клиническую оценку на тяжести воспаления диска зрительного нерва, наручниках сосудов сетчатки, инфильтрации ткани сетчатки и структурном повреждении. Оцените каждый из этих параметров по шкале от одного до пяти. Коллективная сумма является репрезентативной для клинического заболевания для всего глаза с максимальным баллом 20, доступным на глаз.
После визуализации глазного дна для окончательной клинической конечной точки исследования усыпните мышь. Для гистологического анализа разберите веки для доступа ко всему глазу, затем поместите изогнутые щипцы позади земного шара, чтобы захватить орбитальную соединительную ткань и зрительный нерв и энуклеировать глаз. Поместите энуклеированный глаз в один-пять миллилитров 4% глутарового альдегида в течение как минимум 15 минут, прежде чем перевести орган на один-пять миллилитров 10% формальдегида в течение не менее 24 часов.
После окрашивания гистологической ткани, согласно стандартным протоколам, присваиваются баллы по шкале от нуля до трех в зависимости от уровня инфильтрации иммунных клеток и степени поражения сетчатки. Фуноскопические изменения классифицируются во время прогрессирования заболевания как воспалительные изменения, которые включают воспаление ткани сетчатки и сосудистого и зрительного диска и структурное повреждение сетчатки в дополнение к гистологическим изменениям, основанным на инфильтрации иммунных клеток и структурных нарушениях. Эти клинические и гистопатологические изменения могут быть оценены и оценены для оценки прогрессирования заболевания и оценки эффективности терапевтического вмешательства.
Сосудистая утечка также является патологической особенностью модели и увеита человека. Как показано в этом анализе, флуоресцеин может быть использован для визуализации сосудистой утечки в качестве еще одного показания этой модели. Для исследователей важно убедиться, что эмульсия приготовлена правильно без признаков разделения между растворами.
Они должны быть тщательно перемешаны, а конечный продукт должен быть гладким по текстуре. Эта процедура может быть комбинирована с другими методами введения лекарств и с цитометрией для фенотипирования инфильтрирующих популяций иммунных клеток сетчатки.
