Agradecemos a Thomas Wang por desarrollar el prototipo de filamentos von Frey, Patrick J. Huang por mejorar el ensayo de sonda mecánica, el Bloomington Drosophila Stock Center for the control(w1118)y ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP fly stocks, y los miembros del laboratorio Galko por leer críticamente el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por R21NS087360 y R35GM126929 a MJG.

1. Construcción mecánica de sondas
<ol><li>Corte cada filamento nitinol (Figura 1B), perpendicular a su eje largo, a la longitud especificada (Figura 1M–N) utilizando un cortador de alambre pequeño (Figura 1C). Los filamentos vienen en tres diámetros preestajustados diferentes (Figura 1B). NOTA: Las longitudes especificadas aquí son una guía para lograr las presiones aproximadas indicadas, utilizando un protocolo similar para la construcción del montaje. En última instancia, independientemente de la longitud del corte del filamento, y la profundidad del agujero en el soporte, los filamentos deben medirse/calibrarse en un equilibrio para obtener el valor exacto de fuerza/presión.</li>
	<li>Examine la punta del filamento bajo un estereomicroscopio para asegurarse de que no queden bordes afilados o irregulares, ya que estos podrían causar daños tisulares en la piel de las larvas e interferir con la calibración.</li>
	<li>Alisar manualmente los bordes afilados de la sonda mecánica utilizando una piedra afilada hasta que no persistan irregularidades agudas(Figura 1D).</li>
	<li>Haga un agujero hacia el extremo de un palo de paleta de madera(Figura 1E)utilizando una aguja hipodérmica (ver Tabla de Materiales). Inserte la aguja al menos a la mitad de la altura del palo de paleta (Figura 1E). Esto crea una cámara para la inserción del filamento nitinol.</li>
	<li>Aplique pegamento de madera en un solo filamento de nitinol(Figura 1F)e inserte el filamento recubierto de pegamento en la ranura de la aguja en un palo de paleta de madera (Figura 1G). Dejar secar por ~ 5 h.</li>
	<li>Calibra cada sonda mecánica presionándola contra una báscula hasta que la sonda mecánica se doble(Figura 1H-L). Este es el punto de fuerza máxima que se puede registrar en gramos. Dependiendo de los diámetros de filamento (preestajustes) y longitudes (determinadas por el usuario) se puede generar un rango completo de fuerzas y presiones.</li>
	<li>Convierta la masa registrada en el paso 1.6 para forzar en milnewton (mN) usando la fórmula f = ma (La fuerza es igual a la masa multiplicada por la aceleración gravitacional). f: fuerza; m: masa; a: aceleración gravitacional (9,8 m/s2) (Figura 1M).</li>
	<li>Por último, convierta la fuerza calculada en presión (fuerza/área) en kilopascal (kPa) dividiendo la fuerza medida por la superficie de la punta del filamento (Figura 1M). Para calcular el área, convierta el diámetro de los diferentes filamentos de nitinol de pulgadas (0,04", 0,06" y 0,08") a centímetros. A continuación, πr2 (donde, r = el radio de filamento nitinol) determina el área (véase la Figura 1M). La preparación de múltiples sondas utilizando filamentos de diferentes diámetros y longitudes generará un conjunto completo que abarcará el rango de respuesta para las larvas de Drosophila (conjunto de muestras que se muestra en la Figura 1N). NOTA: Compruebe cada sonda mecánica al menos cada 3-4 semanas. Cuando la presión se desvía en más de ± 3% de la medida original, se debe fabricar una nueva sonda mecánica.</li>
</ol>2. Preparación de larvas
<ol><li>Aumentar la cepa de control (w1118) progenie larvaria o larvas que contienen los transgenes ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (para visualizar el daño a las neuronas sensoriales) en los alimentos estándar en una incubadora de 25 °C. Por lo general, las poblaciones se mantienen rutinariamente a 18 °C, pero tanto los padres como las crías larvarias se crían a 25 °C en alimentos estándar de harina de maíz para experimentos. NOTA: Las moscas adultas (cinco machos y diez hembras, relación 1:2) se mantienen en los viales de mosca, para permitir la puesta de huevos, durante aproximadamente 24 h. El tiempo después de la puesta de huevos (AEL) comienza a partir de cuando se retiran los adultos.</li>
	<li>Recoge las terceras larvas instar, después de aproximadamente 96 h de puesta de huevos, chorreando suavemente agua del grifo en el alimento blando que contiene las larvas. Las larvas errantes que han dejado la comida, o que han perdurado espículas anteriores o posteriores, son demasiado grandes/viejas para este ensayo. Las larvas de segunda estrella (~ menos de 4 mm de longitud) son demasiado pequeñas.</li>
	<li>Vierta el contenido de los alimentos de mosca suave en una placa Petri de tamaño estándar limpio (100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Usando fórceps, ordene las larvas de tercio medio (ver Figura 2A)de larvas más pequeñas (segunda instar y tercera instar temprana) o más grandes (tardías o errantes terceras instar). Se recomienda una manipulación suave con fórceps para evitar cualquier daño tisular a las larvas. NOTA: La transferencia utilizando fórceps se basa principalmente en la tensión del agua y no en la aplicación de presión a las larvas con las cuchillas de los fórceps. Una alternativa al uso de fórceps para maniobrar larvas son los pinceles suaves. Con cualquiera de las herramientas, el usuario debe practicar la transferencia de los animales, con el fin de no causar daños tisulares no deseados que podrían complicar las mediciones de comportamiento.</li>
	<li>Transfiera las larvas de la tercera estrella, utilizando fórceps, a una pequeña placa de Petri (30 mm x 15 mm) que contenga un pequeño tapón de alimento para moscas humedecido con agua a temperatura ambiente. Mantenga las larvas en la pequeña placa de Petri hasta que se realicen los experimentos, pero no más de 20 minutos. NOTA: Generalmente, transferir 20-30 larvas al tapón de alimentos dará un número adecuado para 20 minutos de ensayos conductuales.</li>
</ol>3. Ensayo mecánico de nocicepción
<ol><li>Coloque una larva instar de mediados del tercio (usando fórceps) en una delgada almohadilla de vinilo negro u oscuro bajo un estereomicroscopio de campo brillante. El color oscuro proporciona un contraste que mejora la visualización de la larva. Es preferible tener una pieza libremente móvil de vinilo oscuro porque permite al usuario alinear la larva sin tocarla ni lastimarla.</li>
	<li>Coloque las luces de fibra óptica entre las lentes objetivo del microscopio y la almohadilla de vinilo negro u oscuro; esto permitirá una iluminación adecuada de alto contraste para ver la larva.</li>
	<li>Deseche las larvas que no presenten locomoción normal después de la transferencia a la almohadilla. Estos pueden interferir con la respuesta conductual nociceptiva normal. Para obtener una locomoción normal, consulte Vídeo 1.</li>
	<li>Limpie, usando una toalla de papel, cualquier exceso de agua que rodee la larva que pueda hacer que la larva flote en la almohadilla de vinilo.</li>
	<li>Oriente la larva moviendo la almohadilla de vinilo oscuro. La cabeza/boca de la larva debe apuntar a la izquierda si usted es diestro y viceversa si usted es zurdo (Figura 2A-B).</li>
	<li>Aplique la sonda mecánica elegida, normalmente durante 1-2 s, en el lado dorsal posterior de la larva en aproximadamente el segmento abdominal A8 (ver Figura 2B),hasta que la sonda se doble y elicto la cantidad de presión medida previamente(Figura 2C). Es importante que la sonda presione contra la superficie dorsal de la larva y comprima las larvas en la almohadilla subyacente en el punto de contacto de la sonda. NOTA: En el punto de contacto entre la punta del filamento nitinol y la cutícula dorsal-epidermis, las sondas inferiores a 2.300 kPa, se doblan principalmente sin penetrar la cutícula y los tejidos subyacentes. Estas sondas rara vez afectan a la mortalidad larvaria4. A presiones más altas (>5.000 kPa) las sondas se doblan y, ocasionalmente, penetran en la cutícula y los tejidos subyacentes. La punción de las larvas afecta la supervivencia larvaria4 y, si se observa, estas larvas se desechan típicamente del análisis conductual.</li>
	<li>Registre la respuesta conductual de cada larva. Se indica una respuesta nociceptiva positiva(Video 2)si la larva muestra un rollo completo de 360° a lo largo del eje de su cuerpo dentro de 3 s. Otras respuestas (intentar girar, gatear rápidamente y mover) se consideran negativas para los propósitos de este ensayo. NOTA: Las larvas estimuladas con un estímulo mecánico de subtrama (200 kPa) no provocaron la típica respuesta nociceptiva o rodante (Video 3). Algunas larvas mostraron respuestas táctiles rápidas o ligeras, como cambios en la dirección del movimiento.</li>
	<li>Deseche la larva y prepare la siguiente para el ensayo, repitiendo los pasos 3.1 a 3.7.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1–3.7 hasta que se alcance el número deseado de larvas (aquí se utilizaron de tres a seis conjuntos de n = 10 larvas para cada sonda). NOTA: Cuando se utilizan sondas mecánicas de menor presión (174-462 kPa), el ensayo tomará más tiempo por larva. Esto se debe a que la punta de filamentos más largos oscila más, lo que hace más difícil meter la larva en el centro del segmento A8. La práctica es necesaria con estas sondas.</li>
</ol>4. Microscopía confocal para evaluar la morfología neuronal
<ol><li>Coloque una larva (de genotipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP para etiquetar neuronas sensoriales) previamente estimulada con un filamento nitinol en una cámara de éterización dentro de un frasco de Coplin que contiene un vaso de precipitados de 10 ml que lleva una bola de algodón empapada con ~1 ml de éter dietil. Deja que la larva se siente en la cámara durante ~5 min. NOTA: En un estudio anterior publicado por nuestro grupo12se proporciona un protocolo detallado para la eterización.</li>
	<li>Enjuague la larva suavemente de la cámara de éterización en una pequeña placa de Petri.</li>
	<li>Tenga listo una diapositiva de microscopio, dos pequeños cubrebotas (22 x 22 mm) y un clip de cubierta largo (22 x 54 mm) (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir pequeñas gotas de solución de éter:aceite (1:5 relación de éter etílico a solución de aceite de halocarbono, ver Tabla de Materiales)a ambos extremos de la diapositiva, luego coloque los pequeños cubrecabezas en la parte superior de las pequeñas gotas. Esta disposición crea una pequeña brecha espacial donde la larva puede caber. NOTA: Presione los pequeños puntos de cubierta contra la diapositiva del microscopio hasta que sea difícil de deslizar.</li>
	<li>Añadir algunas gotas de ether:solución de aceite en el medio de la diapositiva del microscopio y luego colocar la larva, usando fórceps, en el centro de la diapositiva del microscopio (entre las pequeñas manchas de cubierta). Asegúrese de que el eje anteroposterior de la larva es paralelo al lado corto de la diapositiva y que el lado dorsal está mirando hacia arriba.</li>
	<li>Cubra las larvas con la mancha de cubierta larga colocada en la parte superior de la larva y las dos cubiertas más pequeñas. NOTA: Presione generosamente el punto de cubierta largo hasta que la larva esté casi plana.</li>
	<li>Imagen del segmento A8 de la larva utilizando un microscopio confocal (ver Tabla de materiales)utilizando longitud de onda láser 488 (GFP). NOTA: Imagen de la larva inmediatamente porque la anestesia a través del éter se desvanecerá rápidamente (~5-10 min) y la larva se despertará y se moverá, lo que complicará más imágenes.</li>
	<li>Capture imágenes de pila Z a una resolución de 1024 x 1024 píxeles utilizando una lente objetivo seca de apertura numérica (NA) de 20x a 1x zoom, tamaño de paso de 1,5 μm.</li>
</ol>5. Cuantificación del daño tisular
<ol><li>Recopile y convierta las imágenes de pila de la serie Z, de la sección 4.8, en una sola proyección Z (un aplanamiento de varias imágenes tomadas en diferentes planos focales en una sola imagen compuesta). Esto se puede realizar utilizando software disponible comercialmente (por ejemplo, Olympus Fluoview) o cualquier plataforma de código abierto equivalente, por ejemplo, Fiji/Image J. Guarde la proyección Z única en el formato TIFF.</li>
	<li>Abra el programa de análisis de imágenes Fiji/ImageJ.</li>
	<li>Haga clic en Archivo, en la barra de menús, y seleccione Abrir desde la ventana que se muestra.</li>
	<li>Seleccione la proyección de una sola imagen almacenada, guardada en el formato TIFF, que desea analizar.</li>
	<li>Haga clic en Editar, en la barra de menús y seleccione la opción Invertir en la ventana que se muestra.</li>
	<li>Haga clic en la imagen, en la barra de menús, luego seleccione Ajustar, desde la ventana que se muestra, y finalmente seleccione el Brillo / Contraste opción.</li>
	<li>Seleccione la opción Forma a mano alzada de la barra de herramientas para medir el área del hueco (si existe).</li>
	<li>Haga clic en Analizar, en la barra de menús y seleccione la opción Medir. Esto mostrará el área del hueco o la herida.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li><li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pickpocket+is+a+DEG/ENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae.">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li><li>Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+chemical+nociception+in+Drosophila+larvae.">An assay for chemical nociception in Drosophila larvae.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).</li><li>Lopez-Bellido, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+signaling+regulates+mechanical+nociception+in+flies+and+vertebrates.">Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates.</a> Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+and+neuromodulatory+feedback+facilitate+Drosophila+mechanonociceptive+behavior.">Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).</li><li>Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Drosophila+Piezo+in+mechanical+nociception.">The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception.</a> Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization.">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li><li>Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-induced+cold+sensitization+in+Drosophila+larvae+involves+behavioral+shifts+that+require+the+TRP+channel+Brv1.">Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1.</a> PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).</li><li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila.">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> eLife. 4, 10735 (2015).</li><li>Cervero, F., Merskey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+noxious+stimulus.">What is a noxious stimulus.</a> Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).</li><li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae.">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).</li><li>Follansbee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+nociceptive+sensitization+requires+BMP+signaling+via+the+canonical+SMAD+pathway.">Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway.</a> Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).</li><li>Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+insulin+receptor+regulates+the+persistence+of+injury-induced+nociceptive+sensitization.">Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (5), (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+caspase+activity+is+required+independently+of+apoptosis+to+produce+active+TNF/Eiger+during+nociceptive+sensitization.">Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), 2786 (2017).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li><li>Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPK26+in+Drosophila+larval+mechanical+nociception.">The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception.</a> Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).</li><li>Takagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+connectivity+of+homologous+command-like+neurons+mediates+segment-specific+touch+responses+in+Drosophila.">Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila.</a> Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Modificamos un ensayo mecánico establecido1,2,16 utilizando sondas mecánicas personalizadas fabricadas a partir de filamentos de nitinol. Esta aleación metálica nos permite utilizar filamentos de menor diámetro que son apropiados para el tamaño de las larvas de Drosophila. Los monofilamentos basados en líneas de pesca han dominado el campo de la nocicepción mecánica de mosca hasta la fecha2,5,6,16. Nuestros filamentos de nitinol mantienen su forma y presión medida durante aproximadamente ~ 3-5 meses (en nuestra experiencia). Al variar la longitud y el diámetro de los filamentos de nitinol, el usuario puede generar una amplia gama de presiones que abarcan desde la subtención hasta una respuesta de rodadura casi completa. En particular, hacer sondas de subtramo es más simple con los filamentos de nitinol de menor diámetro. Usando estas sondas, encontramos que la presión, en lugar de la fuerza, provoca respuestas conductuales nocifensivas más consistentes4. Aquí demostramos, utilizando una sensibilización nociceptiva inducida por UV bien establecida modelo7,10,13,que estos filamentos también son una herramienta útil para estudiar la hipersensibilidad mecánica: la alodinia y la hiperalgesia.
Estudios previos utilizando sondas mecánicas fabricadas a partir de la línea de pesca han dado lugar a una cierta variabilidad en la capacidad de respuesta conductual2,6,16,17. Varios factores pueden explicar esto. En primer lugar, porque la presión es la variable importante, el pulido de la punta del filamento para que esté redondeada y no tenga bordes afilados es fundamental. En segundo lugar, informar de valores de presión en lugar de sólo fuerza es importante para la reproducibilidad de los experimentos, porque diferentes sondas mecánicas que generan fuerzas similares pueden provocar presiones dispares4. En tercer lugar, es fundamental aplicar sólo una estimulación mecánica por larva utilizando sondas nocivas, ya que tales sondas producen un daño tisular dependiente de la dosis a nivel epidérmico4 y neuronal sensorial (Figura 2E). Un segundo estímulo mecánico nocivo o posterior, después de que se haya inducido daño tisular, podría afectar concebiblemente la función de las neuronas sensoriales periféricas afectadas y provocar una respuesta conductual alterada. En otro estudio, las larvas estimuladas dos veces con sondas mecánicas nocivas mostraron principalmente una respuesta conductual mejorada5,lo que sugiere el desarrollo de una sensibilización mecánica aguda (hiperalgesia), que podría resultar del daño tisular provocado por el primer estímulo mecánico nocivo. Por el contrario, otros autores6 informaron de una respuesta conductual mixta (aumentada o disminuida), lo que indica que la respuesta conductual alterada podría deberse al daño/disfunción del tejido neuronal. Estimular cada larva sólo una vez elimina la posible varianza en las respuestas conductuales resultantes de la sensibilización o el daño tisular. En cuarto lugar, estimulamos mecánicamente el segmento A8, que es más posterior que estudios anteriores (áreas preferidas A3–A4)2,5,16. Las sondas entre ~3,900 kPa y 5,300 kPa aplicadas a cualquiera de los segmentos A2 o A8 no mostraron ninguna diferencia de comportamiento4. Además, el A8, en comparación con el A2-A4, es más fácil de estimular con sondas mecánicas que generan presiones más bajas (<300 kPa) porque la larva es más delgada en esta región y por lo tanto se comprime más fácilmente. Otros estudios mostraron que la estimulación mecánica nociva del extremo posterior de la larva (entregada por un pasador rígido de insectos, sostenido con fórceps) evocaba principalmente locomoción hacia adelante, en lugar de una respuesta aversiva o rodante18. Esta respuesta conductual diferente podría deberse a diferencias en las propiedades de los materiales usados (filamento nitinol doblable vs pasador de insecto incompresible) o a diferentes presiones entregadas a las larvas (no se informó del valor de presión del pasador de insectos).
El desarrollo de un ensayo mecánico de nocicepción para larvas de Drosophila ha permitido al campo descubrir que diferentes canales mecánicos sensoriales de iones y circuitos neuronales median la nocicepción mecánica5,6,16,17. Sin embargo, el estudio de la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) se ha retrasado, en comparación con la sensibilización de las otras modalidades sensoriales — calor7,8,10,13,14,frío9y químico3. Este retraso puede deberse en parte a la ausencia de sondas mecánicas adecuadas que pueden generar un rango de respuesta completo que abarca el subtenimiento a presiones supratensiones. De particular importancia, especialmente para evaluar la alodynia mecánica, son sondas subthreshold que no provocan una respuesta laminadora aversiva de larvas no injuradas. La importancia de nuestras sondas mecánicas mejoradas es que se pueden fabricar para abarcar estímulos inofensivos (subtensiones ~174 kPa–200 kPa) o el rango bajo a alto nocivo (suprathreshold ~225 kPa a ~5,116 kPa). Aquí, demostramos usando los filamentos tipo nitinol von Frey que las larvas de Drosophila desarrollan alodinia mecánica e hiperalgesia mecánica después de la irradiación UV. La sensibilización mecánica muestra algunas diferencias en comparación con la sensibilización térmica. Tanto el inicio como el pico de sensibilización mecánica son anteriores (~4 h) en comparación con la sensibilización térmica (calor) (~8 h para hiperalgesia y ~24 h para la alodinia)7. Además, la alodinia mecánica y la hiperalgesia son concomitantes (ambos pico a ~4 h). Además, mientras que la sensibilización térmica (alodinia e hiperalgesia) se resuelve por completo en los puntos de tiempoposterior 7,la hipersensibilidad mecánica exhibió una larga cola que se mantuvo ligeramente por encima de la línea de base. La sensibilización fría en Drosophila implica un cambio en los comportamientos evocados en frío9 y la aparición de nuevos comportamientos evocados por el frío, un fenómeno que no se observa con estimulación mecánica. Estas diferencias en los comportamientos de inicio, duración y observado sugieren que cada modalidad sensorial puede ser controlada por diferentes vías de señalización. La combinación del ensayo de sensibilización descrito aquí con las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila debería permitir una disección genética precisa de la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) observada.

Las larvas de Drosophila presentan un comportamiento ondulante aversivo característico cuando se exponen a diferentes estímulos nocivos: térmico1,mecánico2y químico3. Este comportamiento es claramente distinto de la locomoción normal. Aquí describimos un ensayo mecánico mejorado que se puede utilizar para evaluar la nocicepción mecánica y la sensibilización mecánica.
En un estudio reciente, fabricamos filamentos similares a von Frey usando alambres de nitinol4. Las sondas que ejercen diferentes fuerzas y presiones se hicieron variando las longitudes y diámetros de los cables nitinoles que forman cada sonda. Las sondas mecánicas fueron calibradas y los valores de fuerza medidos (en milnewton, mN) se convirtieron a presión (kilopascal, kPa), basado en el área de la punta de cada sonda4. La fabricación personalizada de sondas mecánicas nos permitió generar presiones de subtema (≤200 kPa) a suprathreshold (225 kPa a 5318 kPa), lo que podría, en principio, ser beneficioso para estudiar la hipersensibilidad mecánica. Usando estos filamentos mecánicos mejorados similares a von Frey, mostramos que la presión4,a diferencia de la fuerza previamente examinada2,5,6 se correlaciona más consistentemente con la capacidad de respuesta conductual aversiva en larvas de Drosophila. El ensayo mecánico mejorado descrito aquí también ayudó a identificar un factor de crecimiento endotelial vascular conservado (VEGF) receptor tirosina quinasa señalización de una vía que regula la nocicepción mecánica en moscas y ratas4.
La alodinia mecánica y la hiperalgesia, dos modalidades de hipersensibilidad, son relativamente infraprestigadas en larvas de Drosophila, en comparación con las modalidades térmicas (calor y frío) y sensorial química3,7,8,9,10. Esto es probablemente debido a la falta de sondas mecánicas específicas que van desde estímulos inocuos hasta el alto rango nocivo2,5,6. Un estímulo normalmente inocuo que provoca el comportamiento típico de laminación aversiva después de que las larvas de Drosophila experimentan daño tisular3,7 se conoce como alodinia. Una respuesta rodante exagerada a un estímulo típicamente nocivo se conoce como hiperalgesia7. Los estímulos nocivos se definen como aquellos que provocan daño tisular y pueden activar nociceptores11. Los estímulos nocivos entregados a las larvas de Drosophila dañan la epidermis de barrera, las neuronas sensoriales nociceptivas periféricas3,4,7o ambas.
En este artículo, demostramos cómo fabricar y calibrar a medida sondas mecánicas similares a von Frey que son apropiadas para larvas de Drosophila. Además, mostramos cómo utilizar estas sondas para avisar de respuestas nociceptivas mecánicas en larvas de Drosophila. Por último, demostramos además la utilidad de estas sondas utilizándolas para demostrar la presencia de hipersensibilidad mecánica, tanto alodinia como hiperalgesia, tras el daño tisular en larvas de Drosophila (ver Resultados representativos).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540C</td>
			<td>Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black (Arkansas) bench stone</td>
			<td>Dan&#8217;s Whetstone</td>
			<td>SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td>
			<td>Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>Any equivalent confocal microscope will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-816</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E138-500</td>
			<td>For anesthetizing larvae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etherization chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Guide</td>
			<td>Schott AG</td>
			<td>A08575</td>
			<td>Schott Dual Gooseneck 23 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>FS-1670</td>
			<td>For transferring larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Aleene&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aleene&#39;s&#174; Wood Glue, formerly called (Aleene&#39;s All-Purpose Wood Glue) 
			https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graspable holder</td>
			<td>Loew Cornell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle 30G 1/2&#34;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1471286</td>
			<td>BD Precisionglide&#174; syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Zeiss) Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td>NT55-605</td>
			<td>Any equivalent microscope will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x40</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-224</td>
			<td>Tickness 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Globe Scientific Inc.</td>
			<td>1358Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Diagonal Cutter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S43981</td>
			<td>For cutting nitinol filaments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitinol filaments, Diameters: 0.004&#8221;, 0.006&#8221;, 0.008&#8221;</td>
			<td>Mailin Co</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fifteen pieces of each diameter of 12&#8221; length were ordered. 
			https://malinco.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piece of black vinyl</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td>35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>3605</td>
			<td>Control strain for behavioral assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ppk-Gal4&#62;UAS-mCD8-GFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>8749</td>
			<td>Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved assay and tools for measuring mechanical nociception in drosophila larvae

Los ensayos publicados para la nocicepción mecánica en Drosophila han dado lugar a evaluaciones variables del comportamiento. Aquí, fabricamos, para su uso con larvas de Drosophila, filamentos metálicos personalizados de aleación de níquel-titanio (nitinol). Estas sondas mecánicas son similares a los filamentos von Frey utilizados en vertebrados para medir la nocicepción mecánica. Aquí, demostramos cómo hacer y calibrar estas sondas mecánicas y cómo generar una dosis-respuesta conductual completa desde estímulos subthreshold (rango inocuo o no nocivo) hasta estímulos suprathreshold (rango nocivo bajo a alto). Para demostrar la utilidad de las sondas, investigamos la hipersensibilidad inducida por daños tisulares en larvas de Drosophila. Todavía no se han establecido alodiciones mecánicas mecánicas (hipersensibilidad a un estímulo mecánico normalmente inocuo) e hiperalgesia (respuesta exagerada a un estímulo mecánico nocivo) en larvas de Drosophila. Usando sondas mecánicas que normalmente son inocuas o sondas que normalmente provocan un comportamiento aversivo, encontramos que las larvas de Drosophila desarrollan hipersensibilidad mecánica (tanto alodimonia como hiperalgesia) después de daño tisular. Por lo tanto, las sondas mecánicas y el ensayo que ilustramos aquí probablemente serán herramientas importantes para diseccionar los mecanismos moleculares/genéticos fundamentales de la hipersensibilidad mecánica.

Desarrollamos sondas mecánicas personalizadas, utilizando filamentos nitinoles(Figura 1A,N),para provocar comportamientos evocados mecánicamente y generamos una curva de respuesta a dosis conductual completa utilizando sondas mecánicas inocuas y nocivas de intensidad variable(Figura 2D)que demuestran que estas sondas se pueden utilizar para estudiar la nocicepción mecánica basal (en ausencia de lesión).
Nuestros resultados de ensayo conductual determinaron que las sondas que ejercen presiones inferiores a 200 kPa (~1,57 mN) (Figura 1M),cuando se aplican a larvas de Drosophila, no provocan una respuesta de balanceo aversiva(Figura 2D y Video 3). Como era de esperar, estas sondas mecánicas subthreshold o no nocivas (175 kPa o 200 kPa) no provocaron daño visible del tejido neuronal(Figura 2E). Debido a que no inducen daño, tales sondas podrían ser útiles para evaluar la alodinia mecánica (hipersensibilidad a un estímulo mecánico normalmente no no nocivo). Por el contrario, las sondas suprarretiendas o nocivas (de 462 kPa a 5.116 kPa), provocaron una respuesta conductual aumentada(Figura 2D)de manera dependiente de la dosis, con las presiones más altas que provocan respuestas conductuales más fuertes. Como se preveía, la presión mecánica supratenso también indujo daño tisular dependiente de la dosis a las propias neuronas sensoriales periféricas(Figura 2E). El área medida de daño tisular (en μm2 ± desviación estándar) tomada de cuatro larvas para cada grupo fue: 2,051.03 ± 703.81 (462 kPa), 5,102.29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) y 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). Por lo tanto, las presiones superiores o iguales a 462 kPa (~63 mN), que evocan una respuesta laminada aversiva (en el 25% o más de las larvas) y causan daño visible del tejido neuronal(Figura 2E),podrían ser apropiadas para estudiar hiperalgesia mecánica (hipersensibilidad a estímulos mecánicos normalmente nocivos). Las sondas mecánicas nociceptivas (≥462 kPa) siempre inducen daño tisular (n = 10, evaluado cualitativamente) pero no siempre provocan una respuesta laminada aversiva.
Para evaluar la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia), utilizamos un modelo larvario de Drosophila bien establecido de sensibilización nociceptiva que utiliza irradiación de luz ultravioleta (UV) para inducir daño tisular7,12. Este ensayo ha ayudado a diseccionar los mecanismos genéticos y celulares de la hipersensibilidad nociceptiva térmica8,9,10,13,14,15. Para determinar si el tratamiento UV causa alodinia mecánica, las larvas de control de tercio instar medio(w1118)fueron irradiadas simuladas o irradiadas uv (15-20 mJ/cm2) (Figura 3A). A continuación, las larvas se probaron de forma conductual a las 2 h, 4 h, 8 h, 16 h y 24 h después del tratamiento con una sonda mecánica normalmente subtenida (200 kPa, 1,57 mN). Aproximadamente el 20% de las larvas respondieron tan pronto como 2 h después del tratamiento uv, mientras que el 50% respondió a 4 h, en comparación con el 6,6% y el 8,3% de los animales irradiados uv simulados, respectivamente (Figura 3B). Esto indica que el daño tisular inducido por rayos UV causa alodinia mecánica a 4 h después de la irradiación. En los momentos posteriores (8 h, 16 h y 24 h) la respuesta conductual de las larvas tratadas con UV estaba en el rango de 16%-20% de los respondedores (media promedio de n = 3-6 juegos de 10 larvas cada una), ligeramente aumentada (pero no estadísticamente significativa) en comparación con el grupo de control simulado-irradiado (en el rango de 3%-6% de los respondedores, media promedio de n = 3–6 juegos de 10 larvas cada uno) (Figura 3B).
Para investigar la hiperalgesia mecánica, se utilizó una presión suprarrestenscente (462 kPa, 3,63 mN), que normalmente induce una respuesta laminante aversiva en ~20% de larvas(Figura 2D)y causa daño neuronal del tejido(Figura 2E). Aplicamos la sonda de 462 kPa en el lado dorsal de las larvas con o sin daño tisular inducido por uv(Figura 3A). Encontramos que las larvas sondearon a 4 h, 8 h y 16 h después del tratamiento UV mostraron un aumento significativo en la respuesta laminada aversiva, siendo 4 h el pico de la hipersensibilidad conductual (~60% sensible); animales irradiados uv simulados mostraron un ~27% de respuesta aversiva (Figura 3C). Al igual que la alodinia mecánica, la respuesta conductual a 8 h, 16 h y 24 h de animales tratados con UV (en el rango de 36%-42%) era estadísticamente indistinguible de las larvas no tratadas (en el rango de 20%-26%). Las larvas en la tercera etapa de la estrella mostraron una ligera disminución de la respuesta conductual basal en comparación con la tercera etapa de la estrella media. Hipotemos que esto podría ser por el aumento del tamaño de las larvas(Figura 2A)o el aumento del espesor de la cutícula que cubre el cuerpo. Este hecho podría explicar por qué en una etapa posterior de desarrollo el tratamiento UV no induce una mayor sensibilización mecánica, como se observó 4 h después del tratamiento UV.
En conjunto, nuestros resultados indican que las larvas de Drosophila desarrollan alodinia mecánica e hiperalgesia mecánica después del daño tisular inducido por los rayos UV. La hora punta de la alodinia mecánica y la hiperalgesia es la misma, 4 h después del tratamiento uv; sin embargo, la hiperalgesia mecánica tiene una cola temporal más pronunciada, ya que vuelve a la línea de base más lentamente en comparación con la alodinia mecánica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg"> Figura 1: Desarrollo de una herramienta similar a Von Frey para evaluar la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. (A) Imagen de una sonda mecánica utilizada para estudiar la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. (B) Los filamentos de nitinol y sus diámetros relativos se muestran a escala relativa. (C) Imagen del cortador de alambre diagonal utilizado para cortar los filamentos de nitinol. (D) Suavizando los bordes afilados del filamento nitinol cortado con una piedra afilada. (E) Aguja hipodérmica utilizada para hacer un agujero en el mango del palo de paleta de madera de la sonda. La punta de la aguja necesita alcanzar al menos la mitad de la altura del bastón para una inserción segura del filamento. (F–G) Fijación del filamento de nitinol encolado en un mango de palo de paleta de madera con agujero de inserción. (H–L) Calibración de sondas mecánicas presionándolas contra una báscula. (M) Valores de fuerza (en mN) y presión (en kPa) generados por diferentes sondas mecánicas. La longitud de cada filamento de nitinol utilizado para construir las sondas (P1–P10; P: sonda) se detalla en centímetros (cm). (N) Una imagen de un conjunto completo de sondas mecánicas, que van desde 174 kPa a 5.116 kPa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg"> Figura 2: Ensayo mecánico de nocicepción: Los filamentos similares a von Frey generan una curva de dosis-respuesta de comportamiento rodante aversivo y causan daño tisular a las neuronas sensoriales. (A) Imágenes de las diferentes etapas (segunda y tercera instar) de larvas de Drosophila. Barra de escala: 2 mm. (B) Caricatura de la vista dorsal de la tercera instar Larvas de Drosophila. El punto rojo indica el segmento abdominal donde se aplica la sonda mecánica. T: segmento torácico; R: segmento abdominal. Otros puntos de referencia anatómicos están etiquetados. (C) Caricatura del ensayo: Una sonda mecánica se aplica al lado dorsal de la larva hasta que se dobla contra la superficie de abajo y luego se mantiene durante 2 s. Si la presión es lo suficientemente alta, esto provoca una respuesta de balanceo aversiva al ser liberada. (D) Respuesta de dosis conductual; cada punto azul representa el porcentaje de larvas que respondieron, con laminación aversiva, a la estimulación mecánica dentro de un conjunto de 10 animales. Trama de violín del porcentaje de comportamiento rodante aversivo inducido por diferentes sondas mecánicas. kPa: kilopascales. Las parcelas de caja representan mediana (verde), bigotes (rojo) representan los percentiles 10 y 90. (E) Daño tisular: Las terceras larvas instar (de genotipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP para etiquetar neuronas sensoriales nociceptivas) fueron sondeados en el segmento dorsal A8 con las presiones indicadas. A continuación, se examinaron las neuronas sensoriales ddaC de clase IV etiquetadas fluorescentemente (a través de la línea media dorsal) (ver secciones 4 y 5). Las áreas blancas (asteriscos rojos) representan huecos o daño tisular. Barra de escala: 100 μm. En el panel B, la larva se muestra en la vista dorsal, mientras que en C es la vista lateral. Las sondas mecánicas presionadas contra el lado dorsal cutícula-epidermis de la larva producen una depresión similar al bolsillo en el punto de contacto de la punta de la sonda y las áreas circundantes. La sólida línea negra curvada hacia el lado ventral es la parte superior del bolsillo, mientras que la línea lateral gris discontinua representa el lado lateral y la parte inferior del bolsillo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg"> Figura 3: Hipersensibilidad mecánica después de daño UV. (A) Esquema del diseño experimental para probar la sensibilización. A mediados del tercio de la estrella se trataron simulados (no UV) o irradiados uv. A continuación, el ensayo mecánico de nocicepción se realizó en diferentes puntos de tiempo (2 h, 4 h, 8 h, 16 h y 24 h) tras simulacro de tratamiento o irradiación. (B) Alodinia mecánica: El porcentaje de larvas que exhiben laminación aversiva después de sondear con un estímulo mecánico normalmente subthreshold o no nocivo (200 kPa, 1,57 mN) en los puntos de tiempo indicados después del simulacro de tratamiento o irradiación UV. (C) Hiperalgesia mecánica: El porcentaje de larvas que exhiben laminación aversiva después de sondear con un estímulo mecánico normalmente suprarrespetuoso o nocivo (462 kPa, 3,63 mN) en los puntos de tiempo indicados después del simulacro o la irradiación UV. Las barras de error indican que la prueba tsin asfaltado de dos colas se utilizó para el análisis estadístico: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: no significativo. Cada punto rojo, en los paneles B y C, representa la proporción media de 10 larvas, n = 3-6 conjuntos por punto de tiempo/condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video 1: Locomoción normal de larvas de Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Estimulación mecánica nociva de larvas de Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 3: Subtramestre la estimulación mecánica de las larvas de Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo realizar un ensayo mejorado para la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. Utilizamos el ensayo aquí para demostrar que la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) existe en las larvas de Drosophila.

Un ensayo mejorado y herramientas para medir la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

an-improved-assay-tools-for-measuring-mechanical-nociception

Research

JoVE Journal

Behavior

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

4.7K vistas.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo realizar un ensayo mejorado para la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. Utilizamos el ensayo aquí para demostrar que la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) existe en las larvas de Drosophila.

Video: An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure multiple dimensions of unconditioned behavior in small laboratory mammals (e.g., mice, rats, tree shrews and small primates). This paradigm is a valuable alternative for the use of a behavioral test battery, since a broad behavioral spectrum of an animal&#8217;s behavioral profile can be investigated in one single test.
The apparatus consists of a box, representing the &#8216;protected&#8217; area, separated from a group compartment. A board, on which small cylinders are staggered in three lines, is placed in the center of the box, representing the &#8216;unprotected&#8217; area of the set-up. The cognitive abilities of the animals can be measured by baiting some cylinders on the board and measuring the working and reference memory. Other unconditioned behavior, such as activity-related-, anxiety-related- and social behavior, can be observed using this paradigm. Behavioral flexibility and the ability to habituate to a novel environment can additionally be observed by subjecting the animals to multiple trials in the mHB, revealing insight into the animals&#8217; adaptive capacities.
Due to testing order effects in a behavioral test battery, na&#239;ve animals should be used for each individual experiment. By testing multiple behavioral dimensions in a single paradigm and thereby circumventing this issue, the number of experimental animals used is reduced. Furthermore, by avoiding social isolation during testing and without the need to food deprive the animals, the mHB represents a behavioral test system, inducing if any, very low amount of stress.

This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.

La Junta Agujero Modificado - Medición de Comportamiento, Cognición e interacción social en ratones y ratas

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Investigación

Comportamiento

An Innovative Running Wheel-based Mechanism for Improved Rat Training Performance

This study presents an animal mobility system, equipped with a positioning running wheel (PRW), as a way to quantify the efficacy of an exercise activity for reducing the severity of the effects of the stroke&#160;in rats. This system provides more effective animal exercise training than commercially available systems such as treadmills and motorized running wheels (MRWs). In contrast to an MRW that can only achieve speeds below 20 m/min, rats are permitted to run at a stable speed of 30 m/min on a more spacious and high-density rubber running track supported by a 15 cm wide acrylic wheel with a diameter of 55 cm in this work. Using a predefined adaptive acceleration curve, the system not only reduces the operator error but also trains the rats to run persistently until a specified intensity is reached. As a way to evaluate the exercise effectiveness, real-time position of a rat is detected by four pairs of infrared sensors deployed on the running wheel. Once an adaptive acceleration curve is initiated using a microcontroller, the data obtained by the infrared sensors are automatically recorded and analyzed in a computer. For comparison purposes, 3 week training is conducted on rats using a treadmill, an MRW and a PRW. After surgically inducing middle cerebral artery occlusion (MCAo), modified neurological severity scores (mNSS) and an inclined plane test were conducted to assess the neurological damages to the rats. PRW is experimentally validated as the most effective among such animal mobility systems. Furthermore, an exercise effectiveness measure, based on rat position analysis, showed that there is a high negative correlation between the effective exercise and the infarct volume, and can be employed to quantify a rat training in any type of brain damage reduction&#160;experiments.

This study presents an innovative running wheel-based animal mobility system to quantify an effective exercise activity in rats. A rat-friendly testbed is built, using a predefined adaptive acceleration curve, and a high correlation between the effective exercise rate and the infarct volume suggests the protocol&#39;s potential for stroke prevention experiments.

Un mecanismo basado en la rueda de funcionamiento innovador para mejorar el rendimiento de formación de la rata

This study presents an animal mobility system, equipped with a positioning running wheel (PRW), as a way to quantify the efficacy of an exercise activity ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

Un ensayo Geotaxis negativa iterativo rápido automatizado para analizar comportamiento escalar adulto en un modelo de Drosophila de la neurodegeneración

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation in mouse models is a non-invasive and reproducible activity assay that is directly analogous to measures of patient ambulation such as the 6-minute walk test and related mobility scores. Many common methods for testing mouse ambulation speed and distance are based on the open field test, where an animal&#39;s free movement within an arena is measured over time. One major downside to this approach is that commercial software and equipment for high-resolution motion tracking is expensive and may require transferring mice to specialized facilities for testing. Here, we describe a low-cost, video-based system for measuring mouse ambulation that utilizes free and open-source software. Using this protocol, we demonstrate that voluntary ambulation in the dystrophin-null mdx mouse model for Duchenne muscular dystrophy (DMD) is decreased relative to wild-type mouse activity. In mdx mice expressing the utrophin transgene, these activity deficits are not observed and the total distance traveled is indistinguishable from wild-type mice. This method is effective for measuring changes in voluntary ambulation associated with dystrophic pathology, and provides a versatile platform that can be readily adapted to diverse research settings.

This protocol describes a flexible, low-cost system for measuring mouse ambulation in an open field activity assay. We show that a 6-minute ambulation assay based on this system detects a decrease in voluntary movement in mdx mice, and accurately distinguishes improvement in a muscle-specific rescue of these animals.

Un análisis Simple y de bajo costo para la medición de actividad en modelos de ratón de la Distrofia Muscular

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen distribution. It is also possible that aberrant behavior of oxygen-sensing neurons could induce hypoxia-like behavior in the presence of normal oxygen levels. In D. melanogaster, development at low oxygen levels results in inhibition of growth and sluggish behavior during the larval phases. However, these established manifestations of oxygen deficit overlap considerably with the phenotypes of many mutations that regulate growth, stress responses or locomotion. As result, there is currently no assay available to identify i) cellular hypoxia induced by a mutation or ii) hypoxia-like behavior when induced by abnormal neuronal behavior.
We have recently identified two distinctive behaviors in D. melanogaster larvae that occur at normal oxygen levels in response to internal detection of hypoxia. First, at all stages, such larvae avoid burrowing into food, often straying far away from a food source. Second, tunneling into a soft substratum, which normally occurs during the wandering third instar stage is completely abolished if larvae are hypoxic. The assay described here is designed to detect and quantitate these behaviors and thus to provide a way to detect hypoxia induced by internal damage rather than low external oxygen. Assay plates with an agar substratum and a central plug of yeast paste are used to support animals through larval life. The positions and state of the larvae are tracked daily as they proceed from first to third instar. The extent of tunneling into the agar substratum during wandering phase is quantitated after pupation using NIH ImageJ. The assay will be of value in determining when hypoxia is a component of a mutant phenotype and thus provide insight into possible sites of action of the gene in question.

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

The protocol describes a simple assay to identify Drosophila melanogaster larvae that are experiencing hypoxia under normal atmospheric oxygen levels. This protocol allows hypoxic larvae to be distinguished from other mutants that show overlapping phenotypes such as sluggishness or slow growth.

Un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de Drosophila melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two behavioral components: a reluctance to avoid humans (passive tameness) and a motivation to approach humans (active tameness). To quantify these components in mice, we previously developed behavioral tests for active tameness, passive tameness, and the willingness to stay on a human hand, each designed to be completed within 3 min. The data obtained were used for selective breeding, with a large number of mice analyzed per generation. The active tameness test measures the movement of the mouse toward a human hand and the contact it engages in. The passive tameness test measures the duration of time that a mouse tolerates human touch. In the stay-on-hand test, a mouse is placed on a human hand and touched slowly using the thumb of that hand; the duration of time that the animal remains on the hand is measured. Here, we describe the test set-up and apparatus, explain the procedures, and discuss the appropriate data analysis. Finally, we explain how to interpret the results.

Tameness in animals includes a reduction of avoidance responses to humans (passive tameness) and an increase in active approaches to humans (active tameness). Here, we describe detailed protocols for three behavioral tests (active tameness, passive tameness, and stay-on-hand tests) to separately measure the active and passive tameness of mice.

Medición activa y pasiva mansedumbre por separado en ratones

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific responses to changing temperatures according to their physiological tolerance and adaptability. Drosophila flies also possess a temperature sensing system that has become fundamental to understanding the neural basis of temperature processing in ectotherms. We present here a temperature-controlled arena that permits fast and precise temperature changes with temporal and spatial control to explore the response of individual flies to changing temperatures. Individual flies are placed in the arena and exposed to pre-programmed temperature challenges, such as uniform gradual increases in temperature to determine reaction norms or spatially distributed temperatures at the same time to determine preferences. Individuals are automatically tracked, allowing the quantification of speed or location preference. This method can be used to rapidly quantify the response over a large range of temperatures to determine temperature performance curves in Drosophila or other insects of similar size. In addition, it can be used for genetic studies to quantify temperature preferences and reactions of mutants or wild-type flies. This method can help uncover the basis of thermal speciation and adaptation, as well as the neural mechanisms behind temperature processing.

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Here we present a protocol to automatically determine the locomotor performance of Drosophila at changing temperatures using a programmable temperature-controlled arena that produces fast and accurate temperature changes in time and space.

Un método automatizado para determinar el rendimiento de Drosophila en respuesta a cambios de temperatura en el espacio y el tiempo

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Measuring the Functional Abilities of Children Aged 3-6 Years Old with Observational Methods and Computer Tools

The analysis of functional abilities and their development in early childhood (0-6 years old) are fundamental aspects among young children with certain types of developmental difficulties that can facilitate prevention, through programmed interventions adapted to the needs of each user (student or patient). There are, however, few investigations to date, that have analyzed the use of automated tools for recording and interpreting the results of the initial assessment. Here, a protocol is presented to examine the functional abilities in early childhood in young children, aged between 3-6 years old, with intellectual disabilities, but the protocol can also be used for ages 0 to 6 years. The protocol makes use of a computer application, eEarlyCare, that facilitates the interpretation of the results of systematic observations, which are recorded in natural environments by professionals trained in early intervention. The software can be used to analyze 11 functional areas (Food Autonomy, Personal Care and Hygiene, Dressing and Undressing Independently, Sphincter Control, Functional Mobility, Communication and Language, Daily Life Routines, Adaptive Behavior and Attention) and a total of 114 different behaviors. Its use facilitates the analysis of the observed abilities and greatly assists early intervention. Compared to other observational methods, it allows a more efficient use of personal and material resources. The use of the computer application facilitates the recording of the observation results, which helps with organization and reflection on the observations. The software displays the observation results on-screen compared to normal developmental parameters. This information can be referred to for decision-making about the most suitable intervention program for each user (student or patient). Likewise, clustering techniques are applied to analyze the relation between the type of intellectual disabilities and functional development identified with the software, a relation that is intended to serve as a guide for early-care professional intervention.

We present a protocol to use a computational tool to record and analyze the functional abilities of children aged 3-6 years old. The protocol facilitates the comparison of these abilities throughout their development and can be used to assess developmental difficulties.

Medición de las habilidades funcionales de los niños de 3 a 6 años de edad con métodos de observación y herramientas informáticas

The analysis of functional abilities and their development in early childhood (0-6 years old) are fundamental aspects among young children with certain ...

An Experimental Paradigm for Measuring the Effects of Ageing on Sentence Processing

Previous studies have found that older adults have greater difficulties in processing syntactically complex sentences than younger adults. However, the exact regions where the difficulties arise have not been fully identified. In this study, a maze task was implemented to investigate how older adults and younger adults differentially processed two types of sentences with different levels of syntactic complexity, namely subject relative clauses and object relative clauses. Participants were asked to choose between two alternatives at each segment of the sentences. The task required participants to engage in a strictly incremental mode of processing. The reading times for each segment were recorded, allowing the quantification of the difficulty of sentence reading. The task allowed us to identify the exact locations of the processing difficulty and thus facilitate a more accurate assessment of the age-related decline in sentence processing. The results indicate that the effect of ageing was found mainly at the head nouns, but not at other regions of the sentences, a finding which suggests that the maze task is an effective method to identify the exact location of the ageing effect on sentence processing. The implications of this experimental paradigm for investigating the effect of ageing on sentence processing are discussed.

Here, we present a protocol to examine the age-related decline in sentence processing using a maze task that allowed us to localize the processing difficulty at each word of the sentences during reading.

Un paradigma experimental para medir los efectos del envejecimiento en el procesamiento de sentencias

Previous studies have found that older adults have greater difficulties in processing syntactically complex sentences than younger adults. However, the ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.