Name: a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a todos los miembros de los Laboratorios Keller y Magie en la Universidad Quinnipiac por sugerencias útiles. En particular, queremos agradecer a Barron L. Lincoln II por el desarrollo de este ensayo de lesión dentro del Laboratorio Keller. También queremos agradecer a la Universidad de Quinnipiac el premio otorgado a LC Keller.

1. Preparación de reactivos y equipos <ol><li> Preparar 1x Disección Buffer (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, 0,02 mM CaCl 2 mM, MgCl 2 20, 10 mM de NaHCO3, sacarosa 115 mM, trehalosa 5 mM, HEPES 5 mM; pH 7,2). </li><li> Preparar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Preparar 1x PBT usando 1x PBS con Triton X-100 al 0,01%. </li><li> Preparar las placas de agar de jugo de frutas. 14 Brevemente, mezclar 30 g de agar en 700 ml de H 2 O y autoclave. Disolver 0,5 g de metil parabeno en 10 ml de etanol y agregar la solución a 300 ml de concentrado de jugo de frutas (uva o manzana). Mezclar el concentrado en una solución de agar autoclavada y verter en las tapas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm. NOTA: La premezcla de poder de agar de uva también se puede comprar de varias compañías (ver Tablas de Materiales ). </li><li> Obtenga pinzas de tamaño 5 que permitan dañar mecánicamente a las larvas. </li><li> Utilice Drosophila CO 2 estándar </sUb&gt; basado aparato de anestesia. </li></ol> 2. Selección de larvas de Drosophila <ol><li> Tome un vial o una botella de Drosophila que contiene larvas errantes de tercer estadio que se han cultivado a 25 ° C. </li><li> Seleccionar diez 2º individuales o larvas 3ª basados en la apariencia. Las larvas de tercer estadio pueden ser identificadas por la aparición de espiráculos ramificados anteriores, mientras que las larvas de segundo estadio son más pequeñas y tienen más espiráculos anteriores de tipo club. NOTA: Las etapas Larval también pueden ser identificadas por el momento. A 25 ° C, las larvas del segundo estadio aparecen aproximadamente 48 h después de la eclosión, y las larvas del tercer estadio se mueven aproximadamente 24 h después. Si están interesados ​​en examinar la neurodegeneración en la NMJ, las larvas de segundo estadio necesitan ser lesionadas. </li></ol> 3. Preparación de larvas de Drosophila para lesiones mecánicas <ol><li> Cuidadosamente recoger las larvas individuales con una pinza o un pincel, siendo cautelosoNo para comprimirlo de todos modos. </li><li> Coloque directamente diez larvas en un plato de vidrio que contenga 1X PBS frío o tampón de disección para eliminar cualquier desecho de alimentos y para desacelerar la motilidad larvaria. </li></ol> 4. Lesión mecánica y tratamiento de larvas de Drosophila <ol><li> Colocar cada larva individual en un aparato de anestesia de CO 2 . </li><li> Bajo un microscopio de disección, cuidadosamente rodar cada larva en su lado dorsal con el fin de visualizar los nervios segmentarios a través de la cutícula. </li><li> Posición de tamaño 5 pinzas de aproximadamente 1/2 a 2/3 de la longitud de la larva a partir de los ganchos boca. Una vez posicionado, pellizque aproximadamente 1/3 de la cutícula ventral que contiene los nervios segmentarios con fórceps de tamaño 5. <ol><li> Para asegurarse de que los nervios segmentales larvales se lesionan, aplique fuerza suficiente para aplastar los nervios segmentarios, pero dejar la cutícula intacta. Para determinar la cantidad correcta de fuerza, aplaste 10 larvas y asegúreseLa tasa de mortalidad después de 5 h es inferior al 50%. </li></ol></li><li> Tras la lesión, transferir cuidadosamente las larvas a una placa de agar de zumo de fruta que contenga aproximadamente 0,5 g de pasta de levadura. Coloque cada larva para que su extremo anterior esté en la pasta de levadura, para la alimentación continua a pesar de la motilidad interrumpida. NOTA: Para asegurar que los nervios segmentales de las larvas se hayan lesionado, se puede observar la motilidad larval interrumpida tras la transferencia a la placa de agar. Las larvas lesionadas se paralizan de forma efectiva posterior al sitio de la lesión, pero todavía pueden mover sus ganchos bucales y alimentarse. Una alta tasa de mortalidad de los animales después de la lesión es común por lo que es mejor dañar 20-50% más animales de lo necesario para un experimento. </li><li> Coloque las placas de agar que contengan pasta de levadura y 10 larvas dañadas en el fondo de una placa de Petri vacía de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de Petri, que ahora contiene las larvas dañadas en una placa de agar con una toalla de papel húmedo, asegurando que la toalla de papel no toque las larvas o las placas de agar. Coloque estoPetri en un recipiente hermético más grande, a RT. </li><li> Recuperar larvas para disección después de períodos especificados (6, 12 o 24 h) después de la lesión. NOTA: Para examinar los efectos inmediatos de la lesión en el citoesqueleto axonal, las larvas pueden ser disecadas directamente después de la lesión. Para examinar defectos de transporte axonal, las larvas pueden ser disecadas aproximadamente 6 h después de la lesión. Alrededor de 12 horas después de la lesión se puede observar una acumulación de proteínas ubiquitinadas, y 24 horas después de la lesión, se puede observar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ. </li></ol> 5. Análisis de la neurodegeneración en el NMJ <ol><li> Disecar Drosophila larval NMJ como se describió anteriormente. 15 , 16 En pocas palabras, ponga las larvas en una placa de Sylgard, corte a lo largo de la superficie dorsal, y filetee con los pernos en una gota del amortiguador de la disección para exponer la musculatura de la pared del cuerpo. Fije las larvas en 4% de paraformaldehído (PFA) o solución de Bouin dependiendo del antiCuerpos utilizados para visualizar neuronas y músculos. NOTA: Debe usarse la fijación de PFA si las etiquetas fluorescentes de la proteína, tales como la proteína fluorescente verde (GFP) se visualizan como fijador de Bouin puede ser demasiado áspera. </li><li> Realizar la inmunofluorescencia, que se ha descrito anteriormente 11 , 13 , 16 , para marcar simultáneamente las neuronas motrices presinápticas y pliegues musculares postsinápticos (SSR) adyacentes. Visualice membranas presinápticas y axones con peroxidasa de rábano conjugado con fluorescencia (HRP) (1: 300) 17 y las zonas activas pueden ser teñidas usando un anticuerpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultáneamente etiquetar los músculos post-sinápticos con un anticuerpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18 </li><li> Realizar un ensayo establecido para cuantificar la neurodegeneración en el NMJ como se describió anteriormente. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Brevemente, visualice simultáneamente NMJ individuales para los compartimentos pre y post-sinápticos. Cualquier boutons etiquetados con marcadores postsinápticos pero no marcadores presinápticos indican sitios de neurodegeneración ( Figura 1 ). El número medio de boutons por NMJ así como el número medio de NMJs por animal puede ser cuantificado. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La lesión mecánica neuronal descrita anteriormente y demostrada aquí puede usarse para inducir lesión / estrés en los nervios segmentarios de larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental se ha empleado previamente para diseccionar la secuencia temporal de los eventos que conducen a la neurodegeneración, así como para examinar los cambios transcripcionales en...

La degeneración neuronal se produce durante el desarrollo normal y puede ser causada por el proceso de envejecimiento natural, lesiones, estrés o estados de enfermedad. Drosophila melanogaster , la mosca común de la fruta, proporciona un organismo modelo simple y poderoso para estudiar la neurodegeneración debido a las notables similitudes en los mecanismos moleculares que impulsan la degeneración de las neuronas. Estas similitudes se destacan por el hecho de que aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados con la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila . 1 Además, numerosos ensayos y herramientas tecnológicas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas se han desarrollado y utilizado en Drosophila. 2 , 3 Dentro de Drosophila , la unión neuromuscular (NMJ) permite el análisis de las propiedades celulares y electrofisiológicas y ha demostrado ser un importante sistema para estudiar la enfermedad neuromuscular debido a la visible nEurón-músculo. 2 En este estudio, describimos un ensayo de lesión neuronal in vivo en larvas de Drosophila que permite la lesión reproducible de los nervios segmentarios. Esta lesión motoneurónica da lugar a una secuencia temporal de eventos celulares que dan como resultado la neurodegeneración en el NMJ 24 h después de la lesión. La capacidad de motoneuronas de lesión reproducible que da lugar a neurodegeneración tiene aplicaciones diversas tales como la identificación de genes específicos requeridos para el proceso degenerativo, la disección de respuestas transcripcionales a lesión neuronal y el análisis de cascadas de señalización protectora. 4 , 5 , 6 Este método también se ha utilizado en combinación con microfluidos para estudiar la degeneración neuronal y la regeneración en animales vivos. 7 Utilizamos un ensayo cuantitativo establecido para examinar la degeneración de las neuronas motorasIon en el Drosophila NMJ después de lesión mecánica. Este ensayo se basa en el hecho de que la pérdida de membrana y proteínas presinápticas precede al desmontaje del retículo subsináptico (SSR) caracterizado por los pliegues de la membrana muscular postsináptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensayo permite la cuantificación de &quot;huellas sinápticas&quot; en las que la neurona pre-sináptica ha perdido la conexión con el músculo postsináptico adyacente. Se ha demostrado que el proceso degenerativo es progresivo a lo largo del desarrollo larvario 12 y no puede explicarse por el desarrollo alterado de la sinapsis o el brote. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 El anuncioLa ventaja de usar lesiones mecánicas sobre mutaciones preexistentes es que permite la disección de la secuencia temporal de eventos celulares que conducen a la neurodegeneración en el NMJ. 13

<table><tbody><tr><td>Micro-dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>Various tank sizes can be purchased</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Anesthetizing Apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel pins, size 0.1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>To pour dissecting plates</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>Dissecting Stereo MIcroscope</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anti- nc82 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&amp;reg; 488, 594 or 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Used to create humid chamber for larval recovery</td></tr></tbody></table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

La degeneración de las neuronas se produce durante el desarrollo normal y en respuesta a lesiones, estrés y enfermedades. Las características celulares de la degeneración neuronal son notablemente similares en los seres humanos e invertebrados como son los mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster , proporciona un poderoso pero simple organismo modelo genético para estudiar las complejidades celulares de las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados a la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila y una plétora de herramientas y ensayos se han descrito utilizando moscas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas. Más específicamente, la unión neuromuscular (NMJ) en Drosophila ha demostrado ser un sistema eficaz para estudiar enfermedades neuromusculares debido a la capacidad de analizar las conexiones estructurales entre la neurona y el músculo. Aquí, informamos sobre un ensayo de lesión de neurona motora in vivo en Drosophila , queInduce de forma reproducible la neurodegeneración en el NMJ por 24 h. Utilizando esta metodología, hemos descrito una secuencia temporal de eventos celulares que resultan en la degeneración de la neurona motora. El método de lesión tiene diversas aplicaciones y también se ha utilizado para identificar genes específicos necesarios para la neurodegeneración y diseccionar las respuestas transcripcionales a la lesión neuronal.

Utilizando el procedimiento presentado aquí, hemos demostrado que la lesión neuronal mecánica permite la disección temporal de los eventos neurodegenerativos. 14 , 18 La secuencia de eventos se ha caracterizado previamente y comienza con una interrupción inmediata del citoesqueleto, seguida de defectos de tráfico axonal, acumulación de proteínas ubiquitinadas y posterior neurodegeneración 24 h después de la lesión. Ant...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneración de Neuronas Motoras

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K vistas.  Quinnipiac University.  Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio. 

Video: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Investigación

Bioingeniería

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Neurociencias

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Biología del Desarrollo

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Un modelo de lesión de Drosophila en Vivo para el estudio de Neurorregeneración en el periférico y sistema nervioso Central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicina

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Evaluación morfológica y funcional de los axónyis y sus sinapsis durante la muerte de Axon en Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

Visualización de la degeneración sináptica en Drosophila adulta en asociación con neurodegeneración

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

Evaluación de la integridad estructural de las uniones neuromusculares del músculo longitudinal dorsal en Drosophila

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neuromuscular Disorders

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observe Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila Larvae

Source: Li, D., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57557/" target="_blank">A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video describes two-photon laser ablation of axons in a Drosophila melanogaster larva and an example protocol to induce injury and image the injury site.

Lesión neuronal inducida por láser de dos fotones: un método para observar la degeneración y regeneración de los axones en larvas de Drosophila

Source: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. 
...

Biología

Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)

Larva

Mechanically Injuring Drosophila Larvae Segmental Nerves to Induce Neurodegeneration

Source: Danella, E. B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56128">A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration.</a> J. Vis. Exp. (2017).
The video demonstrates inducing neurodegeneration in Drosophila larva segmental nerves via mechanical injury. The ventral cuticle of anesthetized larvae is pinched using forceps to cause injury to the segmental nerves. The injured larvae are maintained with food, allowing the injury to cause degeneration of the motor neurons in the nerves, causing disruption of their neuromuscular junctions (NMJs).

Lesión mecánica de los nervios segmentarios de las larvas de Drosophila para inducir neurodegeneración

1. Preparation of Reagents and Equipment 

	Prepare 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sucrose, ...

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en