Nos gustaría agradecer a todos los miembros de los Laboratorios Keller y Magie en la Universidad Quinnipiac por sugerencias útiles. En particular, queremos agradecer a Barron L. Lincoln II por el desarrollo de este ensayo de lesión dentro del Laboratorio Keller. También queremos agradecer a la Universidad de Quinnipiac el premio otorgado a LC Keller.

1. Preparación de reactivos y equipos <ol><li> Preparar 1x Disección Buffer (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, 0,02 mM CaCl 2 mM, MgCl 2 20, 10 mM de NaHCO3, sacarosa 115 mM, trehalosa 5 mM, HEPES 5 mM; pH 7,2). </li><li> Preparar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Preparar 1x PBT usando 1x PBS con Triton X-100 al 0,01%. </li><li> Preparar las placas de agar de jugo de frutas. 14 Brevemente, mezclar 30 g de agar en 700 ml de H 2 O y autoclave. Disolver 0,5 g de metil parabeno en 10 ml de etanol y agregar la solución a 300 ml de concentrado de jugo de frutas (uva o manzana). Mezclar el concentrado en una solución de agar autoclavada y verter en las tapas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm. NOTA: La premezcla de poder de agar de uva también se puede comprar de varias compañías (ver Tablas de Materiales ). </li><li> Obtenga pinzas de tamaño 5 que permitan dañar mecánicamente a las larvas. </li><li> Utilice Drosophila CO 2 estándar </sUb&gt; basado aparato de anestesia. </li></ol> 2. Selección de larvas de Drosophila <ol><li> Tome un vial o una botella de Drosophila que contiene larvas errantes de tercer estadio que se han cultivado a 25 ° C. </li><li> Seleccionar diez 2º individuales o larvas 3ª basados en la apariencia. Las larvas de tercer estadio pueden ser identificadas por la aparición de espiráculos ramificados anteriores, mientras que las larvas de segundo estadio son más pequeñas y tienen más espiráculos anteriores de tipo club. NOTA: Las etapas Larval también pueden ser identificadas por el momento. A 25 ° C, las larvas del segundo estadio aparecen aproximadamente 48 h después de la eclosión, y las larvas del tercer estadio se mueven aproximadamente 24 h después. Si están interesados ​​en examinar la neurodegeneración en la NMJ, las larvas de segundo estadio necesitan ser lesionadas. </li></ol> 3. Preparación de larvas de Drosophila para lesiones mecánicas <ol><li> Cuidadosamente recoger las larvas individuales con una pinza o un pincel, siendo cautelosoNo para comprimirlo de todos modos. </li><li> Coloque directamente diez larvas en un plato de vidrio que contenga 1X PBS frío o tampón de disección para eliminar cualquier desecho de alimentos y para desacelerar la motilidad larvaria. </li></ol> 4. Lesión mecánica y tratamiento de larvas de Drosophila <ol><li> Colocar cada larva individual en un aparato de anestesia de CO 2 . </li><li> Bajo un microscopio de disección, cuidadosamente rodar cada larva en su lado dorsal con el fin de visualizar los nervios segmentarios a través de la cutícula. </li><li> Posición de tamaño 5 pinzas de aproximadamente 1/2 a 2/3 de la longitud de la larva a partir de los ganchos boca. Una vez posicionado, pellizque aproximadamente 1/3 de la cutícula ventral que contiene los nervios segmentarios con fórceps de tamaño 5. <ol><li> Para asegurarse de que los nervios segmentales larvales se lesionan, aplique fuerza suficiente para aplastar los nervios segmentarios, pero dejar la cutícula intacta. Para determinar la cantidad correcta de fuerza, aplaste 10 larvas y asegúreseLa tasa de mortalidad después de 5 h es inferior al 50%. </li></ol></li><li> Tras la lesión, transferir cuidadosamente las larvas a una placa de agar de zumo de fruta que contenga aproximadamente 0,5 g de pasta de levadura. Coloque cada larva para que su extremo anterior esté en la pasta de levadura, para la alimentación continua a pesar de la motilidad interrumpida. NOTA: Para asegurar que los nervios segmentales de las larvas se hayan lesionado, se puede observar la motilidad larval interrumpida tras la transferencia a la placa de agar. Las larvas lesionadas se paralizan de forma efectiva posterior al sitio de la lesión, pero todavía pueden mover sus ganchos bucales y alimentarse. Una alta tasa de mortalidad de los animales después de la lesión es común por lo que es mejor dañar 20-50% más animales de lo necesario para un experimento. </li><li> Coloque las placas de agar que contengan pasta de levadura y 10 larvas dañadas en el fondo de una placa de Petri vacía de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de Petri, que ahora contiene las larvas dañadas en una placa de agar con una toalla de papel húmedo, asegurando que la toalla de papel no toque las larvas o las placas de agar. Coloque estoPetri en un recipiente hermético más grande, a RT. </li><li> Recuperar larvas para disección después de períodos especificados (6, 12 o 24 h) después de la lesión. NOTA: Para examinar los efectos inmediatos de la lesión en el citoesqueleto axonal, las larvas pueden ser disecadas directamente después de la lesión. Para examinar defectos de transporte axonal, las larvas pueden ser disecadas aproximadamente 6 h después de la lesión. Alrededor de 12 horas después de la lesión se puede observar una acumulación de proteínas ubiquitinadas, y 24 horas después de la lesión, se puede observar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ. </li></ol> 5. Análisis de la neurodegeneración en el NMJ <ol><li> Disecar Drosophila larval NMJ como se describió anteriormente. 15 , 16 En pocas palabras, ponga las larvas en una placa de Sylgard, corte a lo largo de la superficie dorsal, y filetee con los pernos en una gota del amortiguador de la disección para exponer la musculatura de la pared del cuerpo. Fije las larvas en 4% de paraformaldehído (PFA) o solución de Bouin dependiendo del antiCuerpos utilizados para visualizar neuronas y músculos. NOTA: Debe usarse la fijación de PFA si las etiquetas fluorescentes de la proteína, tales como la proteína fluorescente verde (GFP) se visualizan como fijador de Bouin puede ser demasiado áspera. </li><li> Realizar la inmunofluorescencia, que se ha descrito anteriormente 11 , 13 , 16 , para marcar simultáneamente las neuronas motrices presinápticas y pliegues musculares postsinápticos (SSR) adyacentes. Visualice membranas presinápticas y axones con peroxidasa de rábano conjugado con fluorescencia (HRP) (1: 300) 17 y las zonas activas pueden ser teñidas usando un anticuerpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultáneamente etiquetar los músculos post-sinápticos con un anticuerpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18 </li><li> Realizar un ensayo establecido para cuantificar la neurodegeneración en el NMJ como se describió anteriormente. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Brevemente, visualice simultáneamente NMJ individuales para los compartimentos pre y post-sinápticos. Cualquier boutons etiquetados con marcadores postsinápticos pero no marcadores presinápticos indican sitios de neurodegeneración ( Figura 1 ). El número medio de boutons por NMJ así como el número medio de NMJs por animal puede ser cuantificado. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La lesión mecánica neuronal descrita anteriormente y demostrada aquí puede usarse para inducir lesión / estrés en los nervios segmentarios de larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental se ha empleado previamente para diseccionar la secuencia temporal de los eventos que conducen a la neurodegeneración, así como para examinar los cambios transcripcionales en los cuerpos de las neuronas motoras después de la lesión. 5 , 14 Además, esta técnica se ha descrito en conjunción con chips microfluídicos para observar y estudiar la degeneración y regeneración axonal en larvas de Drosophila . 7 Las limitaciones de esta técnica incluyen la muerte de las larvas debido a la punción de la cutícula durante la introducción de la lesión. Sin embargo, un gran número de larvas puede ser aplastado en un shPara superar una elevada tasa de mortalidad larvaria. Una modificación que hemos incluido es la lesión de 2 ª instar o temprano larvas 3 ª instar, que es crítico para visualizar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ, que se produce 24 h después de la lesión. Aquí, demostrar que la lesión neuronal puede ser utilizado para estudiar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ. Utilizamos un método establecido para cuantificar la neurodegeneración que aprovecha el hecho de que las neuronas y sus proteínas asociadas degeneran más rápidamente que el músculo adyacente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Para observar y cuantificar la neurodegeneración, es crítico que el NMJ sea teñido simultáneamente para los marcadores pre- y post-sinápticos. Aquí teníamosEmontrar el uso del marcador de zona activa Brp y el marcador postsináptico Dlg, sin embargo, hay una plétora de otros marcadores pre y post-sinápticos disponibles que pueden utilizarse para estudiar la neurodegeneración en el NMJ. Adicionalmente, se pueden emplear moléculas marcadas fluorescentemente de una elección para estudiar sus efectos durante el proceso neurodegenerativo. Existen métodos más complicados para estudiar la degeneración después de la lesión axonal, como la microfluídica 7 , sin embargo, nuestro método tiene varias ventajas: 1) es muy barato, 2) la mayoría de los laboratorios Drosophila ya tienen el equipo necesario, y 3) La microscopía de fluorescencia convencional se puede utilizar para cuantificar los eventos neurodegenerativos después de la lesión. Prevemos que este protocolo puede ser adaptado para examinar una amplia gama de mecanismos celulares y moleculares relacionados con la neurodegeneración después de la lesión. En particular, estos métodos podrían ser utilizados para examinar el behAvior de cualquier proteína marcada fluorescentemente antes y después de la lesión neuronal y la degeneración y regeneración de las neuronas motoras.

La degeneración neuronal se produce durante el desarrollo normal y puede ser causada por el proceso de envejecimiento natural, lesiones, estrés o estados de enfermedad. Drosophila melanogaster , la mosca común de la fruta, proporciona un organismo modelo simple y poderoso para estudiar la neurodegeneración debido a las notables similitudes en los mecanismos moleculares que impulsan la degeneración de las neuronas. Estas similitudes se destacan por el hecho de que aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados con la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila . 1 Además, numerosos ensayos y herramientas tecnológicas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas se han desarrollado y utilizado en Drosophila. 2 , 3 Dentro de Drosophila , la unión neuromuscular (NMJ) permite el análisis de las propiedades celulares y electrofisiológicas y ha demostrado ser un importante sistema para estudiar la enfermedad neuromuscular debido a la visible nEurón-músculo. 2 En este estudio, describimos un ensayo de lesión neuronal in vivo en larvas de Drosophila que permite la lesión reproducible de los nervios segmentarios. Esta lesión motoneurónica da lugar a una secuencia temporal de eventos celulares que dan como resultado la neurodegeneración en el NMJ 24 h después de la lesión. La capacidad de motoneuronas de lesión reproducible que da lugar a neurodegeneración tiene aplicaciones diversas tales como la identificación de genes específicos requeridos para el proceso degenerativo, la disección de respuestas transcripcionales a lesión neuronal y el análisis de cascadas de señalización protectora. 4 , 5 , 6 Este método también se ha utilizado en combinación con microfluidos para estudiar la degeneración neuronal y la regeneración en animales vivos. 7 Utilizamos un ensayo cuantitativo establecido para examinar la degeneración de las neuronas motorasIon en el Drosophila NMJ después de lesión mecánica. Este ensayo se basa en el hecho de que la pérdida de membrana y proteínas presinápticas precede al desmontaje del retículo subsináptico (SSR) caracterizado por los pliegues de la membrana muscular postsináptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensayo permite la cuantificación de &quot;huellas sinápticas&quot; en las que la neurona pre-sináptica ha perdido la conexión con el músculo postsináptico adyacente. Se ha demostrado que el proceso degenerativo es progresivo a lo largo del desarrollo larvario 12 y no puede explicarse por el desarrollo alterado de la sinapsis o el brote. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 El anuncioLa ventaja de usar lesiones mecánicas sobre mutaciones preexistentes es que permite la disección de la secuencia temporal de eventos celulares que conducen a la neurodegeneración en el NMJ. 13

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Air Tank</td>
			<td>Tech Air</td>
			<td>UN 1013</td>
			<td>Various tank sizes can be purchased/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Anesthetizing Apparatus</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel pins, size 0.1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>To pour dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT 10132-1L</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>FLY-8030-20</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereo MIcroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1BZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>HL150-AY-220V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- nc82 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AF3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td>
			<td>One can you Alexa Fluor&#174; 488, 594 or 647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-484C</td>
			<td>Used to create humid chamber for larval recovery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

La degeneración de las neuronas se produce durante el desarrollo normal y en respuesta a lesiones, estrés y enfermedades. Las características celulares de la degeneración neuronal son notablemente similares en los seres humanos e invertebrados como son los mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster , proporciona un poderoso pero simple organismo modelo genético para estudiar las complejidades celulares de las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados a la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila y una plétora de herramientas y ensayos se han descrito utilizando moscas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas. Más específicamente, la unión neuromuscular (NMJ) en Drosophila ha demostrado ser un sistema eficaz para estudiar enfermedades neuromusculares debido a la capacidad de analizar las conexiones estructurales entre la neurona y el músculo. Aquí, informamos sobre un ensayo de lesión de neurona motora in vivo en Drosophila , queInduce de forma reproducible la neurodegeneración en el NMJ por 24 h. Utilizando esta metodología, hemos descrito una secuencia temporal de eventos celulares que resultan en la degeneración de la neurona motora. El método de lesión tiene diversas aplicaciones y también se ha utilizado para identificar genes específicos necesarios para la neurodegeneración y diseccionar las respuestas transcripcionales a la lesión neuronal.

Utilizando el procedimiento presentado aquí, hemos demostrado que la lesión neuronal mecánica permite la disección temporal de los eventos neurodegenerativos. 14 , 18 La secuencia de eventos se ha caracterizado previamente y comienza con una interrupción inmediata del citoesqueleto, seguida de defectos de tráfico axonal, acumulación de proteínas ubiquitinadas y posterior neurodegeneración 24 h después de la lesión. Antes de la lesión, WT NMJ muestran el marcador de zona activa presináptica Brp en aposición al marcador postsináptico Dlg a lo largo de todo el NMJ ( Figura 1A ). La lesión mecánica de los nervios segmentarios puede inducir una neurodegeneración moderada a severa en la que los boutons teñidos con Dlg carecen ahora de la proteína de la zona activa presináptica Brp ( Figura 1B ). Cualquier botón que está teñido con Dlg pero carece de tinción Brp se considera un &quot;synhuella APTIC&quot; y puede ser contado y se cuantificó como un evento neurodegenerativa. Tanto la frecuencia y la gravedad del fenotipo neurodegenerativo pueden cuantificarse como se ha descrito anteriormente. 11 <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56128/56128fig1.jpg" /> Figura 1: La lesión neuronal mecánica induce neurodegeneración en el NMJ del músculo 6/7. ( A ) Los NMJ no dañados muestran el marcador de la zona activa pre-sináptica, Brp (verde) en aposición con el marcador postsináptico, Dlg (rojo) a lo largo de todo el NMJ. ( B ) La lesión mecánica neuronal induce la neurodegeneración indicada por los boutons teñidos con Dlg (rojo) con la pérdida de Brp. Las puntas de flecha indican sitios individuales de neurodegeneración. Barra de escala = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56128/56128fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de</a>esta figura.

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A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneración de Neuronas Motoras

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K vistas.  Quinnipiac University.  Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio. 

Video: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Investigación

Neurociencias

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Un método para infligir Cerrado Jefe lesión cerebral traumática en<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

En Vivo Medición electrofisiológica de potencial de acción compuesto del músculo de las extremidades anteriores en modelos de ratón de la degeneración de la motoneurona

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

Visualización de la degeneración sináptica en Drosophila adulta en asociación con neurodegeneración

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...