Hola, y bienvenidos a la arquitectura de laboratorio y reactividad del ARN en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Estrasburgo. Cultivar cristales bien sufractantes es un paso crítico en cualquier estudio cristalográfico. En este vídeo, demostraremos el uso de una nueva herramienta microfluídica para cultivar cristales de una biomolécula y determinar su estructura 3D por difracción in situ de rayos X.
El dispositivo microfluídico llamado ChipX presenta varias ventajas. Está diseñado para miniaturizar y facilitar los activos de cristalización mediante el método de contra-difusión. Su configuración es fácil y se realiza con material de laboratorio estándar.
También está optimizado para la caracterización directa de cristales cultivados en el chip por cristalografía de rayos X en serie. ChipX elimina los pasos de manipulación y crioenfriamiento de cristales y conserva la calidad intrínsica de los cristales que se analizan in situ y a temperatura ambiente. ChipX tiene el formato de una diapositiva de microscopio, de 7,5 por 2,5 centímetros.
Contiene ocho canales microfluídicos utilizados como cámaras de cristalización con una sección de 80 por 18 micrómetros y una longitud de cuatro centímetros. La entrada en el lado izquierdo permite la inyección manual de la solución de biomolécula que llenará los ocho canales hasta los embalses. Las soluciones de cristalización se depositan en estos depósitos en el lado derecho.
La cristalización se desencadena por un fenómeno llamado contra difusión. Cuando el agente cristalizador se difunde en la solución de biomolécula y crea una concentración y un gradiente de super saturación. Las etiquetas y bost a lo largo de los canales ayudan a localizar los cristales más fácilmente.
La configuración de un chip requiere de cinco a seis microlitros de solución de biomolécula a una concentración típica de cinco a 10 miligramos por mililitro. Un aceite de parafina de microlitro, cinco microlitros de solución de cristalización por reservorio y cinta adhesiva. La carga de ChipX se realiza manualmente con un micropipette y puntas estándar.
En este ejemplo se utiliza una solución de ejemplo azul para una mejor visualización del proceso de inyección. Para evitar fugas, la punta se inserta en la entrada de muestra perpendicularmente al chip. Un microlitro de aceite de parafina se carga después de la muestra para separar los canales entre sí.
A continuación, la entrada de muestra se sella con cinta adhesiva. Los ocho depósitos se cargan individualmente con cinco microlitros de solución de agente cristalizador. Para ello, la punta de la pipeta se coloca cerca del extremo del canal en un ángulo de unos 45 grados.
Esto evita la formación de una burbuja de aire entre la muestra y el agente cristalizador. Los embalses se pueden llenar con cócteles que contienen varios tampones, polímeros o sales, etcétera, para su cribado o optimización. Los embalses están sellados con cinta adhesiva.
Como se ha demostrado aquí, configurar un chip es fácil y toma sólo unos minutos. En ChipX, la cristalización se produce mediante la difusión del contador. Los agentes cristalizadores depositados en los depósitos se difunden en los canales que contienen la biomolécula.
Esto crea gradientes de concentración y de super saturación que desencadenarán cristalización. Estos son ejemplos de cristales de una enzima obtenida dentro de los canales. Pueden crecer para llenar los canales que tienen una sección transversal de 80 por 80 micrómetros.
Los cristales son fácilmente detectables en ChipX por microscopía de fluorescencia utilizando la fluorescencia natural de los residuos de triptófano bajo la luz UV, o como se muestra aquí usando una proteína etiquetada fluorescentemente. Esta sección muestra un análisis telegráfico de Chris realizado en la fuente de luz suiza en filaggrins Suiza. Los chips se pueden llevar al sincrotrón sin ningún equipo adicional o cuidado especial.
Entremos en el salón de la fuente de luz suiza. Los electrones circulan en el anillo central y generan un amplio espectro de ondas electromagnéticas, incluyendo rayos X explotados en diferentes líneas de haz. Este video fue grabado en X06, que es una línea de haz dedicada a la cristalografía macro-molecular.
El protocolo puede cambiar de una instalación de sincrotrón a la otra, pero el principio general sigue siendo el mismo. ChipX está montado en un soporte impreso en 3D. Este soporte se une al imán de un goniómetro estándar.
El análisis en serie consistente recopila datos de una serie de cristales cultivados en el chip. Las listas de posiciones cristalinas se establecen utilizando las etiquetas y bost a lo largo de los canales de chip. Los investigadores mueven el chip para centrar los cristales en el haz de rayos X simbolizado por la ventana amarilla.
Se inicia un procedimiento de centrado rápido utilizando el haz de rayos X. La parada del haz sube a su lugar y el detector se mueve hacia la muestra. El cribado de rejilla se realiza para asegurarse de que el cristal está alineado con el haz.
El mismo procedimiento se repite después de girar el chip 30 grados. El segundo paso es importante porque el material de viruta crea un efecto de paralaje que conduce a un cambio del máximo de difracción con respecto a la posición de cristal observada. Tan pronto como el cristal se centra en la viga se inicia la recopilación de datos.
Esta secuencia muestra la recopilación de datos en tiempo real. El chip gira 30 grados. Mientras tanto, las imágenes de difracción correspondientes son recogidas por el detector.
La caracterización de este cristal es completa. El chip se traduce al siguiente cristal del canal y se repite todo el procedimiento. Tenga en cuenta que este análisis se realiza in situ sin el manejo directo del cristal y a temperatura ambiente.
A continuación, los datos recopilados en una serie de cristales se combinan para obtener un dataset de difracción completo que se utiliza para calcular un mapa de densidad de electrones, que se muestra en azul y para crear el modelo atómico. El procedimiento descrito en este video se aplicó en el marco de la caracterización estructural de la enzima de modificación del ARN. La enzima que añade CCA de la bacteria adaptada al frío, Planococcus halocryophilus.
ChipX se utilizó para cristalizar la enzima mediante contra difusión en presencia de sulfuro de amonio como agente cristalizador. Los cristales piramidales aparecieron a lo largo de los canales, después de unos días de incubación a 20 grados centígrados. El etiquetado fluorescente de la proteína facilitó la identificación de los cristales proteicos y su discriminación por los cristales de sal.
Se analizaron una serie de cristales in situ y a temperatura ambiente. Sus datos de difracción se fusionaron y condujeron a la estructura cristalina de la enzima APOE a una resolución de 2,5 angstrom. Además, la difusión del medio ambiente en los canales de chip fue explotada para entregar un sustrato a la enzima que construye los cristales.
En el caso de autos, se añadió un análogo CTP a las soluciones de depósito dos días antes del análisis del sincrotrón. Esto permitió que el compuesto se difunda y llegara al sitio catalítico de la enzima. Como se ve en la estructura cristalina del complejo determinado a una resolución de 2,3 angstrom.
El protocolo demostrado en este vídeo es generalmente aplicable y ha sido probado en una variedad de biomoléculas. Para concluir ChipX es una herramienta de chip lab que integra todos los pasos de un estudio cristalístico y le permite pasar de la solución biomédica a la estructura cristalina en un dispositivo microfluídico único. Gracias por ver este video.
y esperamos haberle convencido de los beneficios de usar ChipX para cristalizar y determinar la estructura cristalina de sus favoritos por Biomolecule.
