Este protocolo facilita la determinación satisfactoria de la estructura del dominio vinculante IKK de NEMO, en su forma no enlazada. Y detalles de su producción y cristalización. El protocolo, aprovecha esta estabilización de la confirmación nativa del fragmento de dominio de unión IKK de NEMO, a través de adaptadores de bobina enrollada, que facilitan la cristalización y la determinación de la estructura.
La biología estructural de NEMO, como objetivo, proporciona una ventaja importante en el desarrollo de inhibidores de la NEMO para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer. Este protocolo puede extenderse a la determinación de la estructura de los complejos NEMO, con inhibidores de péptidos o moléculas pequeñas para el descubrimiento u optimización de fármacos. El plevolco proteico y la concentración, durante la etapa de producción de proteínas, son fundamentales para obtener un dimer NEMO puro.
Limitar la agregación y garantizar la solubilidad en condiciones de cristalización. Demostrando los procedimientos serán Tamar y Amy, estudiantes graduados en nuestro laboratorio. Comience agregando 20 mililitros de excelente solución de caldo.
Y 20 microlitros de una solución de 100 miligramos por mililitro de ampicilina. A un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros. Seguido por unos microlitros de población de glicerol celular, de 80 grados Celsius almacenamiento, de células competentes BL21DE3.
Transformado con vector. Después de agitar el cultivo de arranque durante la noche, a 37 grados centígrados y 220 rotaciones por minuto, diluir las células a un OD600 de 0,1 y 250 mililitros de caldo excelente. Y añadir ampicilina a una concentración final de 100 microgramos por mililitro.
Cuando la OD600 del cultivo alcance 0,8 a 1, agregue IPTG al cultivo, a una concentración de 500 micromolares. Y hacer crecer las células durante cuatro horas, a 37 grados centígrados, hasta que el OD600 alcance de seis a 10. Al final de la incubación, sedimentar las células por centrifugación.
Y re-suspender el pellet en 40 mililitros de tampón de lelisis. Divida las células re-suspendidas en dos alícuotas de 20 a 25 mililitros. Y usa una prensa francesa para aplicar aproximadamente 25.000 libras por pulgada cuadrada de presión a las células, de dos a tres veces por alícuota, en una sala fría.
A continuación, agregue urea a los lysates celulares, a una concentración final de ocho molares. E incubar la solución celular en una plataforma de balanceo durante dos a 16 horas, a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, transfiera los lysates a tubos de ultracentrífusión.a por lo menos tres cuartos de lleno, por tubo.
Y ulrta centrifugar los lysates.durante 45 minutos. Decantar los sobrenadantes en un tubo cónico de 50 mililitros. Y cargue el sobrenadante incubado por urea en una columna IMAC, a tres mililitros por minuto.
Cuando todo el sobrenadante haya corrido a través de la columna, lave la columna para 10 volúmenes de columna, con búfer de enlace, a tres mililitros por minuto. Y realice la elución de gradiente de la proteína NEMO-EEAA de 10 a 500 imidazol milimétrico, sobre un gradiente de volumen de 12 columnas. Recoger un mililitro alícuotas del eluido, en una placa de recogida de fracciones.
Después del análisis de página SDS, tire de las fracciones que contienen la proteína objetivo pura y mida la concentración de proteínas por ensayo de Bradford, de acuerdo con el protocolo estándar. Seleccione las fracciones eludidas, que contienen proteínas. Para cortar la etiqueta HIS6 y eliminar el exceso de imidazol de la muestra, agregue TEV proteasa, en una proporción de peso de uno a 10, de proteína cortada TEV, a la muestra de proteína objetivo.
Y dilatar la muestra durante la noche en cuatro litros de 20 Tris mililares. Cloruro de sodio de 150 milimolares y dos soluciones de TDT miliamlar. A la mañana siguiente, cargue la muestra NEMO-EEAA cortada TEV, en una segunda columna IMAC, a un mililitro por minuto.
Recoger el flujo a través de fracciones de mililitro, en una placa de recolección de fracción de 96 cuencos. Lavar la columna con cinco volúmenes de 20 Tris milimétricos, cloruro de sodio de 150 milimolares y solución de imidazol de 10 milimolar, a un mililitro por minuto. Después del último lavado, eluía el TEV y efiló HIS6 NEMO-EEAA, con tres volúmenes de columna de 20 Tris milimétricos, cloruro de sodio de 150 milivolilares, 500 imidazol milimétrico y dos soluciones de TDT milimiolar, en un matraz de 50 mililitros.
Tire del flujo a través de fracciones, que contienen la construcción NEMO-EEAA cortada y concentrar la muestra con un concentrador de células agitadas, a cinco mililitros. Después de la diálisis durante la noche como se ha demostrado, cargue cinco mililitros de la muestra en columnas de cromatografía de exclusión de 16 milímetros por 60 centímetros de tamaño. Repetir según sea necesario, según el volumen de la muestra.
A un mililitro por minuto, y a dos Tris milimotoras, cloruro de sodio de 100 milimolar y dos solución de DDT mililolar. Después de tirar de las fracciones, correspondientes al dimerico NEMO-EEAA, concentrar la muestra en el concentrador de células agitadas, con una membrana de corte de peso molecular de tres kilodalton, a una concentración final de 113 micromolares. Luego, aliquot la proteína para el almacenamiento a cuatro grados Celsius, por hasta un mes.
Para el cribado de matriz dispersa, agregue 60 microlitros de solución de matriz dispersa en cada uno de los 96 pozos de una placa de cristalización de dos cámaras de caída. Para sentarse y soltar la difusión de vapor. Y añadir la solución proteica a un setter de gota robótica.
A continuación, utilice un setter de gota robótica, para dispensar 100 nanolitros de solución proteica a 1,65 miligramos por mililitro, en una proporción de uno a uno con solución de depósito en la gota uno, a un volumen final de 200 nanolitores. Y añadir 66 nanolitros de solución proteica con 134 nanolitros de solución de depósito, a un volumen final de 200 nanolitros en la gota dos. A continuación, selle inmediatamente la placa con cinta adhesiva de tres pulgadas de ancho.
A continuación, guarde las bandejas en un almacenamiento de imágenes de cristalización, a 20 grados centígrados. Comprobación de las imágenes recogidas automáticamente, para la presencia de cristales, a partir de dos días después de almacenar las placas. Para la generación de stocks de semillas, transfiera toda la gota que contiene el cristal de interés, en 50 microlitros de solución de condición de cristalización, en el vial proporcionado, de un kit de generación de semillas.
Y vórtice el stock de semillas, con 20 segundos de pulsación y 10 segundos de descanso, durante tres minutos. Luego, diluya en serie el stock de semillas, en uno a 10 incrementos, hasta uno a 10.000. Y almacene las diluciones a cuatro grados centígrados, hasta su uso posterior.
Uno o dos días antes del envío al sincrotrón, cortar la cinta de la parte superior del pozo, con el cristal de interés. Y añadir 0,5 microlitros de solución de cristalización que contiene 12%uno, dos propano DiO crioprotector, directamente al pozo. Desalojar suavemente el cristal con un bucle crio.
Saque el cristal del pozo y almacene el cristal que contiene criodato en un disco sumergido en nitrógeno líquido, hasta el envío para la difracción de rayos X. Después de recibir los datos de difracción de rayos X, procese las intensidades escaladas en el servidor STAR e ISO. Utilizando una indexación de cristalografía de rayos X cortada media, de 1.2 para la superficie límite de difracción para los datos.
Y carga sobre Phoenix. Para determinar la estructura, utilice la estructura de rayos X de GCN4 como modelo de búsqueda para el reemplazo molecular, utilizando MRage en Phoenix. La estructura 4DMD, se definirá como un conjunto.
Y la solución MRage se construirá con éxito a la parte de la estructura, correspondiente al adaptador de bobina enrollada terminal final de NEMO-EEAA. al modelo de búsqueda, para ambas cadenas en el dimer. La proteína expresada en exceso aparece en una banda, a aproximadamente 14 kilodalton marcador de peso molecular, antes de la primera purificación de la columna IMAC.
Y muestra una banda monómero y una banda de dimer, a 14 y 28 kilodaltons, respectivamente, después de la primera elución. El escote TEV está prácticamente completo, siguiendo la elución, a través de la segunda columna IMAC. Casi en su totalidad como un dimer, con el peso molecular esperado.
Cromatografía de exclusión de tamaño, muestra un solo pico, eludiendo entre 60 y 65 mililitros, que están respondiendo al dimer. El cribado fino produce cristales que se pueden utilizar para producir un stock de semillas para la producción de cristales NEMO-EEAA, para la recolección de datos. Aquí se muestran los perfiles representativos de difracción de cristales NEMO-EEAA.
El análisis estructural de la proteína NEMO-EEAA, revela una bobina espiral en espiral paralela irregular homodímica, de aproximadamente 175 angstroms de longitud. La región regular de bobina enrollada, abarca la secuencia de adaptador de bobina enrollada ideal, en la terminal final. Y los dos primeros heptads de la secuencia apropiada neMO.
Una bobina enrollada regular, también está presente en la terminal C. Comenzando en el residuo NEMO 97 y abarcando el terminal C ideal adaptador de bobina enrollada. La estructura encuadernada beta IKK, muestra una confirmación de bobina enrollada más abierta, para acomodar el ligando.
Con un mayor espaciado interhelical por uno a 2.2 angstroms en esta región. La estructura de un ligando en NEMO, ofrece un nuevo objetivo para el diseño de inhibidores a través de métodos computacionales. Y para el cribado visual de bolsillos de unión con bibliotecas de moléculas pequeñas.
Ahora tenemos un camino para la cristalización de la construcción NEMO diseñada en complejo con ligandos de moléculas pequeñas. Ayudar en el desarrollo y optimización de una nueva clase de inhibidores.
