El objetivo de este procedimiento es proporcionar orientación para la producción, cristalización y determinación estructural de IKK1-alfa humano con el fin de comprender la base mecanicista de su función de señalización y establecer plataformas para el diseño racional de fármacos. Este método debe ayudar a los investigadores a determinar la estructura de IKK1, que proporcionaría respuestas a las consultas clave en el campo de la señalización inmune. Esta técnica describe un camino simplificado para obtener cristales de proteínas IKK, que son bastante refractarios a la cristalización y para proporcionar diversa información crítica en la superación de cuellos de botella en la determinación de las estructuras.
Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque la generación de cantidades de miligramos de proteína soluble, bien portado, requiere su expresión en las células de insectos, y la cristalización se puede hacer bajo sólo una ventana muy estrecha de condiciones. El procedimiento de reemplazo molecular utilizado para determinar la estructura de IKK1 también puede ser muy complicado, especialmente debido a la mala propiedad de desviación de los cristales, no en el sitio de la unidad asimétrica que contiene muchas moléculas IKK1 en ausencia de modelos de búsqueda adecuados. Demostrando los procedimientos estarán Kyle Shumate y Sonjiala Hotchkiss, estudiantes de mi laboratorio.
En el primer día, placa Sf9 células en dos mililitros de medio de células de insecto Sf903, en cada pozo de una placa de seis pozos e incubar a 27 grados centígrados. Pasar las células cuando alcanzan una densidad de dos a tres veces 10 a las seis células por mililitro en suspensión diluyéndolas a medios frescos, a una densidad de aproximadamente seis veces 10 a las cinco. En el segundo día, diluir ocho microlitros de reactivo de transfección Sf9 en 100 microlitros de SF-903 o Grace's Insect Medium.
A continuación, vórtice la mezcla brevemente. En un tubo separado, diluir un microgramo de bacmid recombinante purificado en 100 microlitros del mismo medio. Combine el ADN diluido y el reactivo de transfección.
Después de incubar a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos, retire el medio del pozo. A continuación, agregue un mililitro de medio fresco. A continuación, agregue la mezcla de reactivo de transfección de ADN diluido a gota en las células, ajustando el tamaño de la gota de manera que no desaloja las células adherentes.
Después de seis horas, agregue 1,5 mililitros de medio fresco encima de las células. Incubar las células a 27 grados centígrados, revisando los pozos periódicamente cada 12 horas en busca de signos de infección viral. En el día cinco, retire el medio que contiene las células, 60 a 72 horas después de la infección.
Después de transferir el medio a tubos, centrifugar durante cinco minutos a 500 veces g y cuatro grados Celsius. Cuando haya terminado, guarde el sobrenadante, que es la pila de virus P1. En el primer día, resuspender el pellet celular His-IKK1 previamente preparado en 40 mililitros de tampón de lelisis.
Coloque la suspensión celular sobre hielo y anlice las células por sonicación en 60%a 70%ciclos de trabajo y cinco a 10 pulsos de 30 segundos de duración en un intervalo superior a un minuto. Aclarar el lesate por centrifugación a mayor o igual a 28.000 g durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Después de preparar una resina de agarosa de níquel-NTA, de acuerdo con el protocolo de texto, eluir la proteína alfa IKK1 etiquetada con su etiqueta bajo flujo de gravedad utilizando 20 mililitros de tampón de elución.
Recoger una a 1,5 fracciones mililitros. Después de combinar las fracciones que contienen la proteína, digiere la muestra con TEV proteasa durante la noche a cuatro grados centígrados. En la mañana del segundo día, incubar la proteína con un milimotor de ATP, en presencia de cloruro de magnesio, betagluerofosfato, fluoruro de sodio y ortovanato de sodio durante una hora a 27 grados centígrados.
Después de la incubación, filtre la solución proteica a través de un filtro de 0,45 micras. A continuación, cargue aproximadamente seis mililitros de la muestra en una columna de exclusión de tamaño preparativo de 120 mililitros, unida a un sistema automatizado de cromatografía líquida. Después del equilibrio, ejecute la cromatografía de exclusión de tamaño a un caudal de un mililitro por minuto y recoja fracciones de dos mililitros.
Durante la ejecución, monitoree la elución a 280 y 254 nanómetros. Después de tirar de las fracciones puras, concéntrese en un concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 30 kilos, siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, dispensar alícuotas de 25 microlitros de la proteína concentrada y congelación del flash en nitrógeno líquido.
Usando un robot, pipetee 80 a 100 microlitros de un reactivo de cristalización en el depósito de una placa de 96 pozos. Usando un robot de cristalización, dispensar y mezclar 0.2 a 0.25 microlitros de IKK1 y su complejo inhibidor con el mismo volumen de solución de depósito. Inmediatamente después de ajustar las gotas, selle cada placa con películas ópticamente transparentes para evitar la evaporación.
Incubar una placa a 18 grados centígrados y la otra placa a cuatro grados centígrados en una sala fría. Utilice un microscopio estéreo con un polarizador para comprobar la apariencia del cristal en cada gota, todos los días, durante los primeros siete días y luego a intervalos más largos. Después de preparar IKK1 y su complejo inhibidor como se ha descrito anteriormente, transfiera las soluciones de pozo a cada pozo de una placa de 24 pozos.
Coloque de una a 1,5 microlitros de solución de pozo en un cubreobjetos de vidrio limpio. Agregue un volumen igual de IKK1 y su complejo de inhibidores al cubreobjetos de vidrio y mezcle suavemente en pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cuatro veces. Después de aplicar grasa en los anillos de cada pocero de la placa, gire el cubreobjetos de vidrio y colóquelo en el pozo respectivo con fórceps.
A continuación, selle el pozo presionando hacia abajo en el cubreobjetos de vidrio. Después de poner todas las gotas en el plato de 24 pozos, incubar en la sala fría, en la oscuridad. Ocasionalmente comprobar las gotas bajo un microscopio para la apariencia y el crecimiento de los cristales.
Una vez que el crecimiento del cristal esté completo, retire suavemente el cubreobjetos de vidrio que contiene el cristal y colóquelo sobre una superficie sólida con el cristal hacia arriba. Añadir suavemente 10 microlitros de crio Solución en la parte superior de la gota y mezclar suavemente por pipeteo para que el cristal no se toque. Con un microscopio, retire lentamente un poco de líquido del cristal y mantenga alrededor de cinco a ocho microlitros de la solución.
Agregue suavemente 2,5 a cuatro microlitros de solución crio B en la gota y mezcle suavemente en pipeteando. Cubra el cubreobjetos de vidrio con un pequeño plato petrie para evitar el flujo de aire directo sobre el cristal. Después de esperar cinco minutos, escoge cuidadosamente un solo cristal de la gota en una crioda apropiada montada sobre una base adecuada.
Congela el cristal en nitrógeno líquido. A continuación, guarde el cristal que contiene crioolopo en un disco sumergido en nitrógeno líquido en un matraz Dewar hasta que esté listo para la difracción de rayos X en el sincrotrón. Después de extensos ensayos con varias variantes diferentes de IKK1, se obtuvieron cristales con una construcción truncada, que mostraba propiedades adecuadas de rayos X sólo en presencia del inhibidor IKK XII.
El efecto combinado de los datos de rayos X de baja resolución con intensidades débiles, un gran número de moléculas IKK1 en la unidad asimétrica y la variación conformacional del modelo monomérico-dimerico IKK1, en comparación con los modelos conocidos IKK2, hizo difícil obtener una solución de reemplazo molecular, IKK1, y determinar su estructura. Diferentes estructuras IKK2 indicaban una orientación inter monómero diferente dentro de sus dimers de modo que la distancia entre los carbonos alfa de P578 en los dos dominios de quinasa, en cuatro modelos de dimer diferentes, variaba entre 39 y 61 angstroms. La obtención de un modelo de búsqueda útil era posible gracias al mapa de microscopía de crioelectrón de baja resolución y a un modelo de alta precisión de dominios IKK1 que se podía generar basado en una estructura IKK2 de alta resolución.
El modelo inicial indicaba una orientación del dominio de la quinasa rotada 24 grados en relación con la de un monómero IKK2 y una abertura N-terminal de 58 angstroms. Usando uno de los dimers con la apertura de 52-angstrom como modelo, se localizaron seis dimers en la unidad asimétrica. Una vez masterada, esta técnica se puede ejecutar en un par de meses, si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la obtención de una proteína soluble, activa y bien portado es el primer paso crítico. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión general de todos los pasos que deben seguirse con minucioso detalle, para tener éxito en la cristalización y determinación de la estructura de la proteína IKK1. Al aprender este procedimiento, todavía hay estructuras de otras proteínas de la familia IKK que también se pueden determinar para responder preguntas adicionales sobre la señalización kinasa-mitógeno.
