Este protocolo se puede utilizar para identificar el papel de dianas moleculares individuales específicas en la regulación de la actividad electrocorticográfica durante diferentes estados de Vigilin. Entre los beneficios del uso del virus adeno-asociado está la capacidad de dirigirse con precisión a una región determinada del cerebro y a un tipo de célula específico. Demostrando el protocolo estará Julien Dufort-Gervais, un investigador asociado de mi equipo.
Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo de pellizco del dedo del dedo del día en un ratón anestesiado de 12 semanas de edad, use un recortador de cabello para afeitar el cabello desde la parte posterior de las orejas hasta la parte frontal de la cabeza entre los ojos. Agregue una generosa gota de ungüento oftálmico a cada ojo para prevenir la deshidratación y use las barras para los oídos para fijar cuidadosamente la cabeza del mouse en un aparato estereotáxico. Saque suavemente la lengua de la boca para evitar la asfixia.
Fije la nariz del ratón al aparato y use etanol al 70% para esterilizar la piel expuesta en la cabeza. Sostenga la piel con pinzas Graefe extrafinas, use tijeras de tejido para cortar la piel desde la base de las orejas hasta el nivel de los ojos y coloque dos pinzas quirúrgicas a cada lado de la incisión para estirar la piel y exponer el cráneo. Evitando las suturas cerebrales, use una punta de tijera para rascar la superficie del cráneo para eliminar el periostio y crear rayas superpuestas en dos o más direcciones.
Use etanol al 70% para eliminar los fragmentos óseos y desinfectar el cráneo. Con una cánula previamente preparada fijada al brazo estereotáxico, identifique la ubicación del bregma y la lambda y anote las coordenadas estereotáxicas de cada uno. Use el brazo estereotáxico y un bolígrafo para marcar la posición de la cánula en el cráneo 1,5 milímetros lateral derecho a la línea media y 1,5 milímetros anterior al bregma.
Usando una broca de 0,7 milímetros, perfore cuidadosamente el cráneo en la posición marcada perpendicular a la superficie del cráneo y alineado con el eje vertical y lave el cráneo con una punta de algodón estéril empapada en una solución de yodo povidona de betadina al 10%, luego retraiga el émbolo de una jeringa de 10 microlitros con un microlitro para cargar la cánula con una burbuja de aire de un microlitro. A continuación, mezcle la mezcla AAV de interés con pipeteo lento y agregue 1.7 microlitros de la mezcla a una placa de Petri estéril. Utilice esta jeringa para cargar 1,5 microlitros de la solución en la cánula y marque la posición de la burbuja de aire en el tubo PE50 conectado.
Alinee verticalmente la cánula con el orificio en el cráneo de tal manera que la cánula llegue al borde superior del hueso y marque la coordenada Z de la superficie del cráneo. Baje lentamente la cánula hasta que la punta alcance 1,5 milímetros por debajo de la superficie del cráneo y la capa cinco de la corteza motora y encienda la bomba de jeringa a una velocidad de flujo de 0,025 microlitros por minuto para administrar un microlitro de AAV durante 40 minutos. Use la burbuja de aire en el tubo para rastrear la inyección, haciendo los ajustes necesarios.
Cuando se haya entregado todo el volumen del virus, deje la cánula en su lugar durante cinco minutos para garantizar una difusión suficiente y evitar el reflujo antes de levantar lenta y cuidadosamente el brazo estereotáxico para eliminar la cánula de la corteza. Para la implantación de electrodos, use fórceps Kelly rectos para atornillar lentamente un electrodo electrocorticográfico con un cable de oro recto en el eje vertical del orificio en el que se inyectó el AAV, dejando al menos 2,5 milímetros de tornillo fuera del cráneo para minimizar el daño a la duramadre y la corteza cerebral. Utilice un bolígrafo para marcar la posición del electrodo de referencia 2,6 milímetros lateral derecho a la línea media y 0,7 milímetros posterior a bregma y la posición del electrodo electrocardiográfico posterior a 1,5 milímetros lateral derecho a la línea media y 1,5 milímetros anterior a lambda y las posiciones de tres tornillos de mantenimiento en el hemisferio izquierdo sin coordenadas específicas, pero lo más distantes posible entre sí y de los electrodos electrocorticográficos.
Use el taladro para perforar cuidadosamente el cráneo perpendicular a la superficie del cráneo en las posiciones marcadas de los otros electrodos y tornillos y lave el cráneo perforado con una solución de yodo de povidona al 10%. Bloquee los orificios con pequeñas piezas enrolladas de delicada limpieza de tareas antes de instalar los tornillos para evitar sangrado y contaminación y use forzadores Kelly rectos para insertar los tornillos en los orificios de perforación en el mismo ángulo en que se perforaron los agujeros. Coloque unas pequeñas gotas de cemento dental en el centro del espacio en forma de anillo dentro de los tornillos y use forrceps Graefe extrafinas para levantar la piel por encima de los músculos del cuello.
Usando las cinco torceps de Dumont, sostenga la extremidad curva de un electrodo electromiográfico e insértela aproximadamente uno o dos milímetros en los músculos. Coloque el lado curvo y el punto de plegado del electrodo en el cemento dental e inserte el segundo electrodo electromiográfico de la misma manera. Después de cubrir los ojos del animal, aplique luz durante tres a cinco minutos para solidificar el cemento y use cemento dental adicional para cubrir la base de los electrodos electrocorticográficos y los tornillos de anclaje para formar un contorno en forma de corona.
Después de aplicar de tres a cinco minutos más de luz, llene el centro del montaje con cemento acrílico y retire las abrazaderas quirúrgicas. Use una sutura de monofilamento absorbible sintética para cerrar la piel en la parte delantera y posterior del montaje para que el cráneo no quede expuesto y use pinzas curvas para sostener el conector por encima del montaje para alinear cuidadosamente los cables dorados de los electrodos con los pines del conector, luego suda rápidamente cada extremidad del electrodo a un solo pin de conector correspondiente. Después de retirar el ratón del marco, cubra el espacio vacío entre el conector y el cabezal con el cemento acrílico.
Y después de pesar, coloque el mouse en una jaula limpia con una tapa sin malla en una almohadilla térmica. Dos semanas después de la cirugía, conecte los ratones a los cables de grabación y, al menos una semana después, registre las señales electrocorticográficas y electromiográficas durante 24 horas o más. Una infección exitosa se confirma por tinción de HA de las neuronas dentro de la corteza motora que rodea el sitio de inyección, lo que indica la presencia de cofilina S3D HA. La co-tinción con el marcador de neurona excitatoria CaMKII alfa indica cofilina clara S3D HA y Co-expresión alfa CaMKII bajo alto aumento.
Los espectros de potencia relativa transformados en log para la vigilia, el sueño de onda lenta y el sueño paradójico muestran diferencias específicas del estado en la actividad espectral bajo inactivación de cofilina. La combinación de registro electrocorticográfico y manipulación mediada por AAV de objetivos moleculares precisos también es aplicable a múltiples regiones del cerebro y a otros subcampos de la neurociencia, como la investigación sobre la epilepsia o la memoria, además del sueño.
