Ce protocole peut être utilisé pour identifier le rôle de cibles moléculaires individuelles spécifiques dans la régulation de l’activité électrocorticographique au cours de différents états de Vigilin. Parmi les avantages de l’utilisation du virus adéno-associé, il y a la capacité de cibler avec précision une région du cerveau donnée et un type de cellule spécifique. Julien Dufort-Gervais, un associé de recherche de mon équipe, fera la démonstration du protocole.
Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pincement des orteils chez une souris anesthésiée de 12 semaines, utilisez une tondeuse à cheveux pour raser les cheveux de l’arrière des oreilles à l’avant de la tête entre les yeux. Ajoutez une généreuse goutte de pommade ophtalmique à chaque œil pour prévenir la déshydratation et utilisez les barres auriculaires pour fixer soigneusement la tête de la souris sur un appareil stéréotaxique. Retirez doucement la langue de la bouche pour éviter l’étouffement.
Fixez le nez de la souris à l’appareil et utilisez de l’éthanol à 70% pour stériliser la peau exposée sur la tête. Tenant la peau avec une pince Graefe extra-fine, utilisez des ciseaux à tissu pour couper la peau de la base des oreilles au niveau des yeux et placez deux pinces chirurgicales de chaque côté de l’incision pour étirer la peau et exposer le crâne. Pour éviter les sutures cérébrales, utilisez une pointe de ciseaux pour gratter la surface du crâne afin d’enlever le périoste et de créer des stries qui se chevauchent dans deux directions ou plus.
Utilisez de l’éthanol à 70% pour enlever les fragments d’os et désinfecter le crâne. Avec une canule préalablement préparée fixée au bras stéréotaxique, identifiez l’emplacement du bregma et du lambda et notez les coordonnées stéréotaxiques de chacun. Utilisez le bras stéréotaxique et un stylo pour marquer la position de la canule sur le crâne de 1,5 millimètre latérale droite à la ligne médiane et 1,5 millimètre antérieur à la bregme.
À l’aide d’un foret de 0,7 millimètre, percer soigneusement le crâne à la position marquée perpendiculaire à la surface du crâne et aligné avec l’axe vertical et laver le crâne avec une pointe de coton stérile imbibée d’une solution d’iode de povidone à 10%de bétadine, puis rétracter le piston d’une seringue de 10 microlitres d’un microlitre pour charger la canule avec une bulle d’air d’un microlitre. Ensuite, mélangez le mélange AAV d’intérêt avec un pipetage lent et ajoutez 1,7 microlitre du mélange à une boîte de Petri stérile. Utilisez cette seringue pour charger 1,5 microlitre de la solution dans la canule et marquer la position de la bulle d’air sur le tube PE50 connecté.
Alignez verticalement la canule avec le trou dans le crâne de sorte que la canule atteigne le bord supérieur de l’os et marque la coordonnée Z de la surface du crâne. Abaissez lentement la canule jusqu’à ce que la pointe atteigne 1,5 millimètre sous la surface du crâne et superposez cinq du cortex moteur et démarrez la pompe à seringue à un débit de 0,025 microlitre par minute pour délivrer un microlitre d’AAV sur 40 minutes. Utilisez la bulle d’air dans le tube pour suivre l’injection, en effectuant les ajustements nécessaires.
Lorsque tout le volume du virus a été délivré, laissez la canule en place pendant cinq minutes pour assurer une diffusion suffisante et éviter le reflux avant de soulever lentement et soigneusement le bras stéréotaxique pour retirer la canule du cortex. Pour l’implantation d’électrodes, utilisez des pinces Kelly droites pour visser lentement une électrode électrocorticographique avec un fil d’or droit dans l’axe vertical du trou dans lequel l’AAV a été injecté, laissant au moins 2,5 millimètres de vis à l’extérieur du crâne pour minimiser les dommages à la dura et au cortex cérébral. Utiliser un stylo pour marquer la position de l’électrode de référence 2,6 millimètres latérale droite à la ligne médiane et 0,7 millimètre postérieur à bregma et la position de l’électrode électrocardiographique postérieure à 1,5 millimètre latéral droit à la ligne médiane et 1,5 millimètre antérieur à lambda et les positions de trois vis de maintenance sur l’hémisphère gauche sans coordonnées spécifiques, mais aussi éloignés que possible les uns des autres et des électrodes électrocorticographiques.
Utilisez la perceuse pour percer soigneusement le crâne perpendiculairement à la surface du crâne aux positions marquées des autres électrodes et vis et lavez le crâne percé avec une solution d’iode à 10% de povidone. Bloquez les trous avec de petites pièces roulées de tâche délicate avant d’installer les vis pour éviter le saignement et la contamination et utilisez des pinces Kelly droites pour insérer les vis dans les trous de forage au même angle que les trous ont été percés. Placez quelques petites gouttes de ciment dentaire au centre de l’espace en forme d’anneau à l’intérieur des vis et utilisez des pinces Graefe extra-fines pour soulever la peau au-dessus des muscles du cou.
À l’aide de la pince numéro cinq de Dumont, tenez l’extrémité incurvée d’une électrode électromyographique et insérez-la d’environ un à deux millimètres dans les muscles. Placez le côté incurvé et le point de pliage de l’électrode dans le ciment dentaire et insérez la deuxième électrode électromyographique de la même manière. Après avoir couvert les yeux de l’animal, appliquez de la lumière pendant trois à cinq minutes pour solidifier le ciment et utilisez du ciment dentaire supplémentaire pour couvrir la base des électrodes électrocorticographiques et les vis d’ancrage pour former un contour en forme de couronne.
Après avoir appliqué trois à cinq minutes supplémentaires de lumière, remplissez le centre du montage avec du ciment acrylique et retirez les pinces chirurgicales. Utilisez une suture monofilament résorbable synthétique pour fermer la peau à l’avant et à l’arrière du montage afin que le crâne ne soit pas exposé et utilisez des pinces incurvées pour maintenir le connecteur au-dessus du montage afin d’aligner soigneusement les fils dorés des électrodes avec les broches du connecteur, puis soudez rapidement chaque extrémité de l’électrode à une seule broche de connecteur correspondante. Après avoir retiré la souris du cadre, couvrez l’espace vide entre le connecteur et la tête avec le ciment acrylique.
Et après la pesée, placez la souris dans une cage propre avec un couvercle sans maille sur un coussin chauffant. Deux semaines après la chirurgie, connectez les souris à des câbles d’enregistrement et au moins une semaine plus tard, enregistrez les signaux électrocorticographiques et électromyographiques pendant 24 heures ou plus. Une infection réussie est confirmée par la coloration HA des neurones dans le cortex moteur entourant le site d’injection, indiquant la présence de cofiline S3D HA. La co-coloration avec le marqueur de neurone excitateur CaMKII alpha indique une co-expression claire de la cofiline S3D HA et de La Co-expression Alpha CaMKII sous un grossissement élevé.
Les spectres de puissance relative transformés par logarithme pour l’éveil, le sommeil à ondes lentes et le sommeil paradoxal montrent des différences spécifiques à l’état dans l’activité spectrale sous l’inactivation de la cofiline. La combinaison de l’enregistrement électrocorticographique et de la manipulation médiée par l’AAV de cibles moléculaires précises est également applicable à plusieurs régions du cerveau et à d’autres sous-domaines des neurosciences tels que la recherche sur l’épilepsie ou la mémoire en plus du sommeil.
