Этот протокол может быть использован для выявления роли конкретных отдельных молекулярных мишеней в регуляции электрокортикографической активности при различных вигилиновых состояниях. Среди преимуществ использования аденоациированного вируса — способность точно нацеливаться на данную область мозга и определенный тип клеток. Демонстрировать протокол будет Жюльен Дюфор-Жерве, научный сотрудник моей команды.
После подтверждения отсутствия реакции на рефлекс защемления ног у анестезируемой 12-недельной мыши, используйте триммер для волос, чтобы сбрить волосы от задней части ушей до передней части головы между глазами. Добавьте щедрую каплю офтальмологической мази на каждый глаз, чтобы предотвратить обезвоживание, и используйте ушные вкладыши, чтобы аккуратно закрепить головку мыши на стереотаксическом аппарате. Осторожно вытяните язык изо рта, чтобы избежать удушья.
Закрепите нос мыши к аппарату и используйте 70% этанол для стерилизации открытой кожи на голове. Удерживая кожу сверхтонкими щипцами Graefe, используйте тканевые ножницы, чтобы разрезать кожу от основания ушей до уровня глаз и поместите два хирургических зажима на каждую сторону разреза, чтобы растянуть кожу и обнажить череп. Избегая мозговых швов, используйте наконечник ножниц, чтобы поцарапать поверхность черепа, чтобы удалить надкостницу и создать перекрывающиеся полосы в двух или более направлениях.
Используйте 70% этанол для удаления фрагментов костей и дезинфекции черепа. С помощью предварительно подготовленной канюли, прикрепленной к стереотаксическому плечу, определите местоположение брегмы и лямбды и запишите стереотаксические координаты каждого из них. Используйте стереотаксическую руку и ручку, чтобы отметить положение канюли на черепе 1,5 миллиметра латерально справа от средней линии и 1,5 миллиметра с передней стороны до брегмы.
Используя 0,7-миллиметровое сверло, аккуратно проткните череп в отмеченном положении перпендикулярно поверхности черепа и выровняйте вертикальную ось и промойте череп стерильным хлопковым наконечником, пропитанным 10%-ным раствором бетадина повидона йода, затем втягивайте поршень 10-микролитрового шприца на один микролитр, чтобы загрузить канюлю одним микролитром воздушного пузыря. Затем смешайте интересующую смесь AAV с медленным пипетированием и добавьте 1,7 микролитра смеси в стерильную чашку Петри. С помощью этого шприца загрузите 1,5 микролитра раствора в канюлю и отметьте положение пузырька воздуха на подключенной трубке PE50.
Вертикально выровняйте канюлю с отверстием в черепе так, чтобы канюля достигла верхнего края кости и отметьте Z-координату поверхности черепа. Медленно опустите канюлю, пока кончик не достигнет 1,5 миллиметра ниже поверхности черепа и пятого слоя моторной коры и запустите шприцевую насос со скоростью потока 0,025 микролитра в минуту, чтобы доставить один микролитр AAV в течение 40 минут. Используйте воздушный пузырь в трубке для отслеживания впрыска, внося необходимые коррективы.
Когда весь объем вируса будет доставлен, оставьте канюлю на месте в течение пяти минут, чтобы обеспечить достаточную диффузию и избежать обратного потока, прежде чем медленно и осторожно поднимать стереотаксическую руку, чтобы удалить канюлю из коры. Для имплантации электрода используйте прямые щипцы Келли, чтобы медленно вкрутить один электрокортикографический электрод с прямой золотой проволокой в вертикальную ось отверстия, в которое был введен AAV, оставив не менее 2,5 миллиметров винта за пределами черепа, чтобы свести к минимуму повреждение твердой мозговой оболочки и коры головного мозга. Используйте перо для обозначения положения опорного электрода 2,6 мм поперечно справа от средней линии и 0,7 миллиметра с задней стороны до брегмы и положения заднего электрокардиографического электрода на 1,5 миллиметра латерально справа от средней линии и 1,5 миллиметра к передней части к лямбде и положения трех шнеков обслуживания на левом полушарии без конкретных координат, но как можно более удаленными друг от друга и от электрокортикографических электродов.
Используйте дрель, чтобы аккуратно проткнуть череп перпендикулярно поверхности черепа в отмеченных положениях других электродов и винтов и промыть проколотый череп 10%-ным раствором повидона йода. Заблокируйте отверстия небольшими свернутыми кусочками деликатной задачи протрите перед установкой винтов, чтобы предотвратить кровотечение и загрязнение, и используйте прямые щипцы Келли, чтобы вставить винты в отверстия сверла под тем же углом, под которым были пробиты отверстия. Поместите несколько небольших капель зубного цемента в центр кольцеобразного пространства внутри винтов и используйте сверхтонкие щипцы Graefe, чтобы поднять кожу над мышцами шеи.
Используя щипцы Дюмона номер пять, удерживайте изогнутую конечность одного электромиографического электрода и вставляйте его примерно на один-два миллиметра в мышцы. Поместите изогнутую сторону и точку складывания электрода в зубной цемент и вставьте второй электромиографический электрод таким же образом. После покрытия глаз животного нанесите свет на три-пять минут, чтобы затвердеть цемент и используйте дополнительный зубной цемент для покрытия основания электрокортикографических электродов и анкерных винтов для формирования короновидного контура.
После нанесения еще трех-пяти минут света заполните центр монтажа акриловым цементом и снимите хирургические зажимы. Используйте синтетический рассасывающиеся монофиламентные швы, чтобы закрыть кожу спереди и сзади монтажа, чтобы череп не подвергался воздействию, и используйте изогнутые щипцы, чтобы удерживать разъем над монтажом, чтобы аккуратно выровнять золотые провода электродов с контактами разъема, а затем быстро припаять каждую оконечность электрода к одному соответствующему контакту разъема. После снятия мыши с рамы закройте пустое пространство между разъемом и головкой акриловым цементом.
А после взвешивания поместите мышь в чистую клетку с несетчатой крышкой на грелке. Через две недели после операции подключите мышей к регистрируемым кабелям и, по крайней мере, через неделю записывайте электрокортикографические и электромиографические сигналы в течение 24 часов или более. Успешная инфекция подтверждается окрашиванием ГК нейронов в моторной коре, окружающей место инъекции, что указывает на наличие кофилина S3D HA. Совместное окрашивание с возбуждающим нейронным маркером CaMKII alpha указывает на четкую кофилиновую кофилин S3D HA и CaMKII альфа-коэкспрессию при высоком увеличении.
Логарифмические преобразованные относительные спектры мощности для бодрствования, медленного волнового сна и парадоксального сна показывают специфические для состояния различия в спектральной активности при инактивации кофилина. Комбинация электрокортикографической записи и AAV-опосредований манипуляций точными молекулярными мишенями также применима к нескольким областям мозга и к другим подполям нейробиологии, таким как исследования эпилепсии или памяти в дополнение ко сну.
