Nuestro enfoque permite controlar la formación de redes neuronales mediante manipulaciones magnéticas. Esta es una herramienta eficaz para los estudios in vitro de redes y ofrece una nueva dirección terapéutica para los dispositivos de biointerfase. Con esta técnica podemos controlar tanto la ubicación de la célula como el crecimiento a escala de micras, permitiendo un diseño flexible del patrón magnético y, por lo tanto, de la organización de la red.
Una nanopartícula magnética eficiente y no tóxica esteriloptic es crucial. Para tener éxito, se necesitan nanopartículas magnéticas apropiadas. Las características importantes son el tamaño, el recubrimiento y el valor de magnetización de la situación.
Demostrando los procedimientos estarán Reut Plen y Dafna Levenberg, estudiantes de maestría para mi laboratorio. Para comenzar, corte los toboganes de vidrio en pedazos de dos por dos centímetros usando una pluma del escribidor. Limpie los portaobjetos de vidrio en acetona y luego isopropanol durante cinco minutos cada uno en un baño de ultrasonidos.
Luego séquelos con nitrógeno de ultra alta pureza. Cubra el vidrio con fotorresistente usando recubrimiento de espín a 6, 000 RPM durante 60 segundos para alcanzar un espesor de 1.5 micrómetros y hornee 100 grados Celsius durante 60 segundos. Exponga la muestra a una fuente de luz utilizando una fotomáscara o una litografía sin máscara para lograr el patrón deseado.
Desarrollar la muestra durante 40 segundos en un revelador diluido en agua destilada según las instrucciones del fabricante. Luego lávelo en agua durante 45 segundos y séquelo con gas nitrógeno UHP. Inspeccione el patrón con un microscopio óptico.
Inserte la muestra en la cámara de bloqueo de carga del sistema de deposición y espere la presión base. Transfiera la muestra en la cámara principal y establezca la muestra a la altura adecuada para la deposición. Aumente la potencia de cada objetivo hasta que se alcance la velocidad deseada.
Active la rotación y, a continuación, deposite la multicapa ferromagnética, alternando entre los objetivos de cobalto, hierro y paladio abriendo y cerrando las persianas objetivo, respectivamente. Deposite 14 bicapas de paladio de hierro cobalto y termine con una capa de tapado de paladio adicional. Una vez completada la deposición, descargue la muestra del sistema de deposición.
Remoje la muestra en acetona durante 30 minutos y enjuáguela con isopropanol. Luego séquelo con nitrógeno UHP y examínese bajo el microscopio. Manténgalo en un ambiente limpio y seco hasta su uso.
Utilice un portaobjetos de vidrio con una barra magnética en forma de cruz de 100 micrómetros de ancho depositado con multicapas ferromagnéticas. Acople la muestra al soporte con cinta de doble cara. Utilice un bonder de alambre para unir cuatro cables a la muestra, uno en cada pierna del electrodo cruzado.
Fije el soporte de la muestra y la muestra dentro del sistema de medición de transporte con un campo magnético para que el campo magnético sea perpendicular a la muestra. Realice las medidas transversales del voltaje según lo descrito en el manuscrito del texto. Barrer el campo magnético y medir el voltaje transversal en función del campo.
Trazar la resistencia transversal en función del campo magnético para determinar la señal hall anómala, que es proporcional a la magnetización perpendicular en la película. Prepare el medio básico de crecimiento y el medio de diferenciación para el cultivo celular PC12 como se describe en el manuscrito del texto. Cultivar células en un matraz de cultivo no tratado con 10 mililitros de medio de crecimiento básico, añadiendo 10 mililitros de medio al matraz cada dos o tres días.
Subcultivo de las células después de ocho días. Para la absorción celular, centrífuga la suspensión celular durante ocho minutos a 200 G y temperatura ambiente, luego deseche el sobrenadante. Resuspend las células en tres mililitros de medio de crecimiento básico fresco.
Centrifugar las células de nuevo durante cinco minutos, a continuación, descartar el sobrenadante y resuspend las células en tres mililitros de medio de diferenciación fresca. Aspirar las células 10 veces usando una jeringa y una aguja para romper los grupos celulares, luego contar las células usando un hemocitómetro y sembrar un millón de células en un plato regular de 35 milímetros sin recubrimiento. Agregue el volumen calculado de suspensión de MNP y medio de diferenciación al plato para lograr la concentración de MNP deseada.
Mezcle las células, los MNPs y el medio de diferenciación, luego incube el plato en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 24 horas. Limpie el sustrato estampado con etanol al 70% y colómelo en un plato de cultivo de 35 milímetros en la campana. Coloque un imán grande debajo del sustrato estampado durante un minuto, luego retírelo moviendo el plato hacia arriba y lejos y sacando el imán de la campana.
Encienda la luz ultravioleta durante 15 minutos. Para preparar un sustrato de vidrio recubierto de colágeno, diluya el colágeno tipo uno en una proporción de uno a 50 en etanol al 30%. Cubra el vidrio con la solución.
Deje el plato al descubierto en la campana durante cuatro horas hasta que toda la solución se evapore, luego lávelo tres veces en PBS estéril. Retire las células de la incubadora, centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 200 G y deseche el sobrenadante. Resuspend las células en un mililitro de medio de diferenciación fresco y contar las células utilizando un hemocitómetro.
Se siembra 10 a las cinco células sobre el sustrato en un plato de cultivo de 35 milímetros y se añaden dos mililitros de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en una incubadora humidificada al 5% de dióxido de carbono a 37 grados Centígrados. Después de 24 horas, agregue de uno a 100 beta-NGF murinos frescos a las células.
Renueve el medio de diferenciación y agregue beta-NGF fresco cada dos días. Imagen de las células cada dos días utilizando microscopía de luz y realizar inmunostaining en las células después de la formación de la red. Se fabricaron plataformas magnéticas con diferentes formas geométricas y se sintetizaron MNPs fluorescentes de óxido de hierro por nucleación.
Las mediciones magnetométricas de los MNPs muestran que la curva de magnetización no tenía histéresis, un campo de saturación baja y una saturación de magnetización relativamente alta. Las células PC12 fueron incubadas en medio mezclado con los MNPs fluorescentes de óxido de hierro, transformándolos en unidades magnéticas. Los MNPs fueron internalizados en el cells' soma, pero no en los núcleos.
La concentración de hierro dentro de las células aumentó con el aumento de la concentración de MNP en el medio. La viabilidad de las células PC12 cargadas MNP para diferentes concentraciones de MNPs se evaluó mediante la comparación de los parámetros morfológicos de las células cargadas MNP utilizando el análisis de bajío, no mostrando ninguna diferencia de las células de control. Los ensayos basados en XTT y Resazurin confirmaron que las concentraciones evaluadas de MNPs no mostraron citotoxicidad significativa hacia las células.
Las células PC12 con y sin el tratamiento del MNP fueron crecidas y distinguidas en un substrato magnético. Las células magnetizadas fueron encontradas para unir a los patrones magnéticos y para crecer ramas según los patrones, mientras que las células sin el tratamiento de MNP crecieron sin afinidad a los dispositivos magnéticos. El posicionamiento de las células en un sustrato con geometría hexagonal se muestra aquí.
El 75% de los cuerpos celulares cargados con MNP estaban en contacto con las bandas magnéticas, mientras que solo el 35% de las células no magnéticas estaban ubicadas en las rayas. Además del efecto de posicionamiento celular, se encontró que estas plataformas magnéticas controlan la direccionalidad de las neuritas en crecimiento. Para evaluar el efecto magnético sobre la direccionalidad del crecimiento neuronal, se midió el ángulo entre las neuritas y las bandas magnéticas, mostrando una correlación significativa con la orientación de las bandas magnéticas.
Este procedimiento se adapta fácilmente para dirigir compuestos activos, como fármacos, después de conjugarlos con nanopartículas magnéticas. El se puede traducir a ensayos de detección de drogas de alto rendimiento o tratamiento local dentro de los tejidos. Este novedoso enfoque abre nuevas posibilidades para funcionalizar otros sustratos o dispositivos mediante la adición de estructuras magnéticas atractivas.
Actualmente, estamos desarrollando interfaces mejoradas de chips de neuronas biocompatibles.
