Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Salud Mental (NIH / NIMH) de subvención # 1R21MH085267.

Parte 1: Preparar un molde maestro para varios compartimientos de neuronas co-cultivo fabricación de dispositivos <ol><li> El primer paso para fabricar el maestro de PMMA es hacer compartimentos 3,5 mm de profundidad. Un compartimiento soma y seis compartimentos axón / glía se definen en un bloque de PMMA utilizando una máquina de fresado micro (MDX-40, Roland o cualquier otra máquina de fresado CNC). PMMA maestro entonces se sonicated en alcohol isopropílico durante 10 minutos para eliminar los residuos. </li><li> Las matrices de 2,5 micras de alta cresta estructuras se modelan en un 50,8 mm x 50,8 mm placa de vidrio por un proceso de fotolitografía estándar, seguido por el grabado húmedo del vaso. En primer lugar, matriz de estructuras cresta se modelan sobre un sustrato de vidrio limpia con un positivo S1818 fotosensible usando fotolitografía. S1818 es spin-revestido en el sustrato (4000 rpm), suave base a 110 ° C durante 5 minutos, y luego se exponen a la luz UV (84 mJ / cm 2) con un alineador de máscara seguido por el desarrollo de la fotoresistencia en MF319 de 40 segundos. A continuación, el sustrato de vidrio fotosensible patrón se encuentra inmersa en óxido de buffer de grabado (BOE) a temperatura ambiente durante 6-7 minutos para obtener un 2,5 micras de altura estructuras cresta. Finalmente, la capa fotosensible es removida con acetona y alcohol isopropílico, seguido por un enjuague en desionizada (DI). </li><li> Sustrato de vidrio con micro-estructuras de cresta es caliente en relieve contra el capitán PMMA para la transferencia de sus patrones. En primer lugar, el maestro PMMA molde y sustratos de vidrio de forma manual alineados y colocados en una prensa en caliente. Entonces, la temperatura se eleva a 115 ° C. Una vez que la temperatura deseada, 0,5 toneladas de peso se aplica durante 5 minutos. Después de 5 minutos, la temperatura se enfría a 40 ° C y la presión es liberada. El maestro de PMMA se corta en un 50,8 mm x 50,8 mm de tamaño de bloque. </li><li> PDMS pre-polímero (Sylgard 184) se mezcla con el endurecedor en la proporción de 10: 1 en peso. </li><li> PMMA maestro se coloca dentro de un barril y la mezcla de PDMS se vierte en la parte superior del maestro PMMA para la fabricación de un maestro de PDMS. Luego se coloca en un desecador conectado a una bomba de vacío. PDMS derramado en la parte superior de PMMA maestro entonces se desgasifica durante 15 minutos para eliminar las burbujas generadas durante el proceso de mezcla de PDMS. </li><li> Cuando las burbujas se eliminan, PDMS se coloca dentro de un horno de nivelado 85 ° C durante una hora para la polimerización. </li><li> Una vez que esté completamente curado PDMS, PDMS maestro se despega del maestro PMMA y colocado dentro de un desecador con 2-3 gotas de triclorosilano y la aspiradora durante 15 minutos para cubrir la superficie de vapor PDMS maestro. Recubrimiento triclorosilano facilita la liberación de la final PDMS neuronas co-cultivo de los productos del maestro de PDMS. Después del recubrimiento, el maestro de PDMS es brevemente enjuagarse con alcohol isopropílico para remover triclorosilano excesiva, y se seca con N 2 gas. </li></ol> Parte 2: la cultura Neurona replicación dispositivo <ol><li> PDMS pre-polímero (Sylgard 184) se mezcla con el endurecedor en la proporción de 10: 1 en peso. </li><li> PDMS mezcla se vierte en la parte superior del maestro PDMS y desgasificar el interior de un desecador conectado a una bomba de vacío durante 15 minutos. Es importante no echar demasiado PDMS para que la estructura de 3,5 mm de alto PDMS en el maestro no está totalmente sumergido. </li><li> Cuando las burbujas se eliminan, PDMS se coloca dentro de un horno de nivelado 85 ° C durante una hora para la polimerización. </li><li> PDMS se saca del horno después de una hora y se deja a temperatura ambiente se enfríe. Entonces, PDMS dispositivos para el cultivo de neuronas se desprendió suavemente del maestro PDMS. Se quitó los dispositivos de PDMS se envuelven con parafilm para protegerlos de polvo o suciedad. </li><li> Dispositivos de PDMS, envuelto con parafilm, se cortan en piezas individuales con un taladro equipado con una cuchilla. </li></ol> Parte 3: montaje de dispositivos <ol><li> PDMS dispositivo cultura neurona se coloca dentro del limpiador de plasma y plasma se expone al aire durante 90 segundos para que la superficie del dispositivo de PDMS hidrofílico. Este tratamiento de plasma que facilitará microcanales que se llena de medios de cultivo después de la asamblea de poli-D-lisina sustrato recubierto. </li><li> Dispositivos de tratamiento con plasma se sumergen en etanol al 70% durante 30 minutos para la esterilización y se esteriliza el interior de la bio-campana. </li><li> Dispositivos esterilizados se sacan de un 70% de etanol y se seca con Millipore filtrada N 2 gas. Dispositivos de secado se colocan en la parte superior de poli-D-lisina de poliestireno recubierto de 6 pocillos placa de cultivo y se aplica presión leve para asegurar la estanqueidad entre el sustrato y el dispositivo. </li><li> Los medios de cultivo se llena en el compartimiento de soma, seguido por el llenado de los seis axón / glía compartimentos. Es mejor dar a 1-2 minutos de pausa antes de llenar axón / glía compartimentos después de la adición de medios de cultivo para el compartimiento de soma para asegurarse de que no queden atrapadas burbujas dentro de los microcanales. </li><li> Dispositivos de llenado con medio de cultivo se incuba dentro de una incubadora de 37 ° C durante la noche para enjuagar cualquier resto o residuo tóxico posible. </li></ol> Parte 4: Célula de carga y las neuronas de oligodendrocitos-co-la cultura <ol><li> En el primer día del cultivo de células, células primarias de las neuronas del cerebro anterior a partir del día embrionario 16 a 18 ratas se cargan en el compartimiento de soma en una densidad de área de 500 células / mm 2. En primer lugar, los medios de cultivo tanto dentro como el compartimiento de soma y axón / glía compartimentos se aspiran con una pipeta antes de la carga de la célula. Luego, las células 38500, diluidas en 40 ml de medios de cultivo, se cargan en el compartimiento de soma alrededor de las entradas de microcanales. Es importante no tocar el dispositivo de PDMS durante la carga de las células, ya que puede romper el sello entre el dispositivo y el sustrato. </li><li> Incubar los dispositivos celulares cargado durante 30 minutos dentro de una incubadora a 37 ° C para mejorar la adhesión celular al sustrato. Después de la incubación, todos los compartimientos son llenados con medio de cultivo. </li><li> Las células se cultivan a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2 y sólo la mitad de los medios de cultivo se cambió a cabo cada 3-4 días. </li><li> Después de 14 días de cultivo in vitro de neuronas, oligodendrocitos se añaden a los compartimentos axón / glía de co-cultivo. Oligodendrocitos, disecados de los hemisferios cerebrales de ratas Sprague-Dawley en el día postnatal 1-2, se añaden a cada compartimento axón / glía en una densidad de área de 1.000 células / mm 2. Antes de las células de carga, aproximadamente el 60% de medios de cultivo dentro de los compartimentos se aspiran con una pipeta. Se debe tener en cuenta no a tocar el substrato del fondo, ya que puede dañar la red axonal formado sobre el sustrato. Entonces, 6700 oligodendrocitos, diluida en 5 l de medio de cultivo, se añaden a los compartimentos axón / glía. Las células se incubaron durante 1 hora y los compartimientos son llenados con medio de cultivo. </li><li> Las células se cultivan a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2 y sólo la mitad de los medios de cultivo se cambió a cabo cada 3-4 días durante dos semanas más. </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: Cuando los experimentos se llevan a cabo correctamente, las células neuronales cargado en el compartimiento de soma localizarse cerca de las entradas y la capa de microcanal axonal comienzan a formarse dentro de los compartimentos axón / glía después de 1 semana de la cultura. Signo de la agregación de células neuronales en el interior del compartimiento de soma puede ser un indicio de que las células no son saludables. Al cargar los oligodendrocitos, después de dos semanas de cultivo de neuronas, el axón / glía compartimentos deben estar cubiertos con una capa densa de axones y oligodendrocitos se debe cargar en la parte superior de la capa axonal. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="la figura 1" /> Figura 1. Ilustraciones esquemáticas de la microfluídica de alto rendimiento de varios compartimentos del SNC las neuronas co-cultivo de la plataforma. Corte transversal que muestra el aislamiento de los axones de soma neuronal y las dendritas, así como el aislamiento de fluidos entre los compartimentos con mínima diferencia de nivel de fluidos. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="la figura 2" /> Figura 2. Fabricación y montaje de los pasos de varios compartimentos PDMS microfluidos co-cultivo de dispositivos. Cada dispositivo se ajusta a un bien de un sistema convencional de 6 pocillos placa de poliestireno de cultivo de células. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2.

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	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hemos desarrollado un compartimiento multi-plataforma de co-cultivo para el estudio de los mamíferos del SNC axón-glia interacción. Axones del SNC se aislaron con éxito de cuerpos celulares neuronales / dendritas, y oligodendrocitos fueron co-cultivadas con éxito en el interior del dispositivo. La densidad de las neuronas puede ser modificado por las aplicaciones, pero una concentración demasiado baja o demasiado alta puede causar que las células mueran. Además, es importante cambiar sólo la mitad de los medios...

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

Presentamos una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma microsistema en el sistema nervioso central la investigación in vitro de interacción axón-glia, capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo de alto rendimiento. Hemos desarrollado un método de fabricación para crear nuevos dispositivos de microfluidos que tienen estructuras de escala micro y macro en el mismo dispositivo a través de un simple proceso de litografía suave, que permite la fabricación en masa con una buena repetibilidad. El compartimiento multi-co-cultivo de microfluidos plataforma se compone de un compartimento de soma de las neuronas y seis compartimentos axón / glía de los oligodendrocitos (MCO). El compartimiento del soma y axón / glía compartimentos están conectados por las matrices de los axones de guía de microcanales que funcionan como barreras físicas para limitar soma neuronal en el compartimiento del soma, al tiempo que permite que los axones crezcan en axón / compartimentos glia. LB carga en compartimentos axón / glía sólo puede interactuar con los axones, pero no con el soma neuronal o dendritas, lo que permite localizadas las células de axón estudios de interacción. Los microcanales también permitió el aislamiento de fluidos entre los compartimientos, permitiendo seis experimentos independientes que se realizará en un solo dispositivo de alto rendimiento. Soft-litografía con poli (dimetilsiloxano) (PDMS) es una técnica muy utilizada en microdispositivos biomédicos. Depósitos en estos dispositivos se define comúnmente por la perforación manual. Aunque la alineación simple, pobre y la naturaleza de tiempo del proceso hace que este proceso no es adecuado cuando un gran número de embalses que se creó en repetidas ocasiones. El nuevo método no requiere la perforación manual de reservorios, la superación de tales limitaciones. En primer lugar, siete depósitos de agua (profundidad: 3.5 mm) se realizaron sobre un poli (metacrilato de metilo) (PMMA) bloque con una máquina de fresado micro. Entonces, las matrices de las microestructuras cresta, fabricado en un sustrato de vidrio, se caliente en relieve contra el bloque de PMMA para definir microcanales que conectan el soma y el axón / glía compartimentos. Este proceso dio lugar a macro-escala de depósitos (3,5 mm) y la micro-escala de los canales (2,5 m) para coincidir con un solo maestro PMMA. Una réplica de PDMS que sirvió como maestro de molde se obtuvo utilizando la litografía blanda, y el último dispositivo de PDMS se ha replicado de este maestro. Neuronas primarias de E16-18 ratas fueron cargados en el compartimento soma y cultivadas durante dos semanas. Después de una semana de cultivo celular, los axones se cruzó microcanales y formó la capa de red axonal sólo dentro de los compartimentos axón / glía. Axones crecieron de manera uniforme a lo largo de seis axón / glía compartimentos y LB de P1-2 ratas se han añadido a los compartimentos axón / glía a los 14 días in vitro para el co-cultivo.

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A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K vistas.  Texas A&M University (TAMU). Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonda de microfluidos: Operación y Uso de tratamiento de superficies localizadas

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

Modificado ES / OP9 Co-cultivo Protocolo establece Caracterización mejorada de la progenie hematopoyética

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...