Este método permite a las personas sin experiencia en electrónica construir instrumentos como este fluorímetro para la amplificación y detección de ácidos nucleicos isotérmicos, que es fundamental para el diagnóstico molecular. La principal ventaja de esta técnica es que el sistema se puede ensamblar completamente a partir de materiales disponibles comercialmente y software de código abierto a un bajo costo. Este fluorímetro se puede utilizar con múltiples métodos de amplificación isotérmica.
Esto es importante porque los métodos isotérmicos de la amplificación se utilizan cada vez más para detectar una amplia gama de enfermedades infecciosas y heredadas. Para montar la carcasa óptica, coloque un inserto roscado de 4-40 de 3/16 pulgadas de largo en el orificio en la parte superior de la pieza STL inferior del gabinete óptico y coloque un inserto roscado de 4-40 de 1/4 de pulgada de largo en todos los demás orificios de la pieza. Inserte la placa de prueba central en la cavidad superior de la carcasa con los cinco pines orientados hacia la parte superior y más cercana al eje central del dispositivo y asegure la placa de prueba con un tornillo 4-40 de 3/16 de pulgada de largo.
Coloque una de las lentes de distancia focal de 20 milímetros en la sección debajo de la placa de prueba central con el lado convexo mirando hacia la parte inferior del dispositivo y lejos de la placa de prueba. Para crear la primera configuración, coloque el filtro de paso largo en la siguiente sección debajo de la lente de distancia focal de 20 milímetros. Para crear la segunda configuración, coloque dos láminas de filtro de emisión amarillas en la sección debajo de la lente.
Para crear la primera configuración, coloque el espejo dicroico en la sección diagonal cerca del centro del encajamiento mientras observa la orientación del filtro especificada por el fabricante. Para crear la segunda configuración, coloque el divisor de haz en la sección diagonal. Coloque una segunda lente de distancia focal de 20 milímetros en la sección debajo del espejo dicroico o divisor de haz dependiendo de la configuración, con el lado convexo apuntando hacia la parte superior del dispositivo.
Para crear la primera configuración, coloque el filtro de excitación en la sección a la derecha del espejo dicroico, asegurándose de que la flecha apunte hacia el espejo dicroico. Para crear la segunda configuración, coloque una lámina de filtro de excitación azul en la sección a la derecha del divisor de haz. Coloque la lente de distancia focal de 15 milímetros a la derecha del filtro de excitación con el lado convexo hacia el espejo dicroico.
Y coloque un LED en la sección restante de la impresión con el LED mirando hacia el espejo dicroico o el divisor de haz, dependiendo de la configuración. Asegúrese de que los dos cables que conducen desde el LED se insertan en los canales de hueco para que la impresión se cierre firmemente. Y repita la configuración para el otro lado de la pieza de impresión 3D.
A continuación, coloque las porciones extruidas de la mitad superior del encaquemento en las ranuras empotradas de la mitad inferior del encierro para cerrar el lado vacío de la pieza con los componentes ópticos. Y asegure las piezas junto con tornillos de 4-40 de 3/8 de pulgada de largo. Para montar la electrónica y la pantalla táctil, conecte las dos mini mesas de pan y coloque el microcontrolador en una de las tablas de pan, asegurándose de que el puerto micro-USB del microcontrolador mira hacia afuera.
Para conectar la modulación LED, conecte el pin CTL del LED+driver a un pin digital del microcontrolador. Y el pin LED del controlador LED a un pin GND del microcontrolador. Retire las cubiertas de plástico en la parte posterior de las tablas de pan y presione el respaldo adhesivo de las tablas de pan a la pieza impresa en 3D para unir las tablas de pan combinadas al interior de la parte posterior de la pieza impresa STL del soporte de pantalla LCD.
Asegure el soporte de la pantalla LCD con las tablas de pan ensambladas dentro de la carcasa óptica con tornillos de 4-40 de 1 pulgada de largo. Para conectar la fuente de alimentación del LED, conecte el pin led positivo del controlador del LED al cable positivo del primer LED. Y conecte el cable negativo del primer LED al cable positivo del segundo LED en la placa de pan.
Conecte el cable negativo del segundo LED al pin led del controlador LED. Para conectar la fuente de alimentación del LED, utilice un conector de barril a un adaptador de 2 pines para conectar los cables positivos y negativos de la fuente de alimentación de 10 voltios a los pines VIN+ y VIN del controlador led, respectivamente. Para conectar la fuente de alimentación de la placa de prueba del sensor y la transferencia de datos, utilice un cable de puente de 4 pines hembra a macho para conectar los pines SCK, SDA, VDUT y GND de las placas de prueba del sensor de luz a digital a la mini placa de pan a través del espacio en la parte superior derecha de la impresión del soporte LCD.
En la placa de navegación, confirme que el pin de 3,3 voltios del microcontrolador y el pin VDUT de ambas placas de prueba, el pin GND del microcontrolador y el pin GND de ambas placas de prueba, el pin analógico de 4 pines del microcontrolador y el pin SDA de ambas placas de prueba, y el pin analógico de 5 pines del microcontrolador , y el pin SCK de ambas placas de prueba están todos conectados. Utilice cuatro tornillos M2.5 para asegurar la computadora de placa única en el soporte de pantalla LCD, con los puertos HDMI y adaptador de corriente de la computadora de placa única mirando hacia arriba y la computadora de placa única centrada en la parte impresa en 3D. A continuación, conecte la pantalla táctil a la computadora de placa única de acuerdo con las instrucciones de la pantalla táctil.
Y conecte el puerto HDMI de la computadora de placa única al puerto HDMI de la pantalla táctil. Para registrar los datos de fluorescencia en tiempo real, después de que el bloque de calor se haya encendido y haya alcanzado la temperatura adecuada, enciéndase la computadora de placa única y use un cable micro-USB a USB para conectar la computadora de placa única al microcontrolador. Abra el script de Python proporcionado en la pantalla táctil y cambie el tiempo de medición.
Cambie la ruta de acceso del archivo de salida variable por el nombre del archivo de datos que genera el programa. Y cambie las variables de puerto serie a los valores deseados. Coloque dos tubos de PCR que contengan las reacciones a controlar en el bloque de calor.
Y coloque el fluorímetro en el bloque de calor con los tubos de PCR centrados entre las cuatro clavijas que extruyen de cada canal óptico. Después de confirmar que el fluorímetro impreso en 3D está conectado, conecte el adaptador de la fuente de alimentación para los LED e inicie el programa Python. Aparecerá una interfaz gráfica de usuario en la pantalla LCD para medir la fluorescencia en tiempo real en ambos tubos de PCR.
Al final del experimento, vea las mediciones y los archivos de datos de salida guardados en la ubicación definida por el usuario. Una vez montado, el rendimiento del fluorímetro se puede validar midiendo la fluorescencia de una serie de dilución de colorante FITC. En este análisis representativo, ambos canales del fluorímetro mostraron una respuesta lineal a través del rango deseado.
Aquí se muestran la fluorescencia sustraída por la línea de base de la amplificación de la polimerasa recombinasa positiva y las reacciones de control negativas de un kit comercial estándar medido en la segunda configuración del fluorímetro. Las mediciones de fluorescencia en tiempo real de una reacción de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa personalizada para el ARN de SARS-COVID-2 en la primera configuración del fluorímetro muestran que la amplificación se produce como se esperaba en un rango clínicamente relevante de números de copias de ARN. En un momento en que las cadenas de suministro globales están muy estresadas, los equipos de código abierto como este fluorímetro pueden ayudarnos a reducir algunas de las inequidades en salud que están asociadas con la pandemia.
