Este protocolo puede detectar específicamente nanocristales que contienen calcio en la orina humana. Esta técnica podría potencialmente ser útil para predecir los primeros tiempos de la formación de la piedra de riñón así como otras enfermedades asociadas a urea cristalina. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Parveen Kumar, un investigador IV en mi laboratorio.
Haga que los participantes consuman una dieta baja en oxalato durante tres días y ayunen durante la noche. Luego recoja una muestra de orina de 24 horas de los participantes antes de que consuman una carga de oxalato. Alimente a los participantes con un batido que contenga frutas y verduras con una carga de oxalato de aproximadamente ocho milimoles.
Haga que los participantes recojan su orina durante 24 horas después del consumo de oxalato y la devuelvan al día siguiente. Mantenga todas las muestras de orina a temperatura ambiente antes del procesamiento. Mida y registre el pH de la orina y el volumen de las muestras de orina.
Mezcle bien y agregue 50 mililitros de orina en un tubo cónico estéril etiquetado de 50 mililitros. Centrífuga la muestra a 1, 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa. Deseche el sobrenadante, luego lave y resuspiente el pellet nuevamente con cinco mililitros de etanol 100%.
Centrífuga la muestra a 1, 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa. Deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en un mililitro de etanol al 100%. Guarde la muestra a menos 20 grados Centígrados para su posterior procesamiento o proceda inmediatamente con la tinción de las muestras.
Diluya nanopartículas de oro de tamaño de 100 nanómetros en agua ultrapura en una proporción de 1:1,000 y utilícelos para optimizar los ajustes del instrumento. Diluya las muestras de orina 20 veces en agua antes de la tinción con cinco milimoares Fluo-4 AM durante 30 minutos en la oscuridad y analice las muestras usando NTA. Prepare el oxalato del calcio y los cristales del fosfato de calcio según lo descrito en el manuscrito del texto antes del análisis de NTA.
Encienda la computadora y el instrumento, luego abra el software y encienda la cámara. Haga clic en el icono de captura en la esquina superior izquierda de la ventana para iniciar el modo de captura. Limpie la plataforma bombeando primero aire en ella usando una jeringa de un mililitro hasta que la plataforma parezca limpia.
Agregue suavemente agua al aparato dos o tres veces y use otra jeringa de un mililitro para eliminar cualquier burbuja de aire. Una vez que la plataforma esté limpia, agregue agua y verifique si hay contaminación en la superficie viendo la cámara, luego agregue nanopartículas de oro como control al inyector de la bomba de carga de muestras para configurar el instrumento. Ajuste el nivel de la cámara en la pantalla o en la perilla del lado derecho del instrumento hasta que la imagen comience a mostrar píxeles de colores y, a continuación, reduzca el nivel de la cámara.
A continuación, ajuste la pantalla para optimizar la imagen. Haga clic con el botón izquierdo del ratón en la imagen de vídeo. Mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón y arrastre la imagen hacia arriba y hacia abajo para obtener toda la vista.
Configure la velocidad de infusión y enfoque la cámara para que las nanopartículas de oro sean visibles en la pantalla de la cámara. Establezca la velocidad de infusión en alta para la configuración inicial para asegurarse de que se detectan las nanopartículas de oro. Una vez detectado, reduzca la velocidad a 50 microlitros por minuto para visualizar nanopartículas de oro.
Ajuste el nivel de la cámara para visualizar las partículas. Para muestras no manchadas, ajuste la ganancia de pantalla en el nivel cinco para lograr el enfoque de la cámara y establezca el nivel de la cámara en ocho. Una vez establecido el foco, registre el ejemplo.
Después de la optimización, vuelva a limpiar el aparato con agua antes de evaluar otras muestras para asegurarse de que el tubo esté limpio y las partículas no estén presentes. Para analizar las muestras teñidas, ajuste la cámara a la posición del filtro que contiene el filtro fluorescente adecuado y cargue las muestras diluidas y teñidas en el inyector de la bomba de carga de la muestra, reduciendo la velocidad a 20 microlitros por minuto para el análisis. Ajuste la ganancia de pantalla a cinco y el nivel de la cámara a 13.
Guarde los datos después de cada medición. Calcule el número promedio de nanopartículas para las cinco lecturas de cada muestra individual y analice los datos utilizando la desviación estándar o el error estándar de la media. Utilice pruebas T para el análisis por pareado.
Fluo-4 AM fue capaz de unirse tanto a los cristales de oxalato de calcio, que tenían entre 50 y 270 nanómetros de tamaño y tenían una concentración media de 1,260 millones de partículas por mililitro, como a los cristales de fosfato de calcio, que estaban entre 30 y 225 nanómetros y tenían una concentración media de 2, 220 millones de partículas por mililitro. Las muestras de orina de 24 horas recogidas antes de que la carga del oxalato contuviera algunos nanocrystals urinarios entre 110 a 300 nanómetros de tamaño. En cambio, había un aumento significativo en nanocrystals urinarios presentes en muestras del poste-oxalato.
Para confirmar la reproducibilidad del método, las muestras se midieron tres veces y no hubo variación significativa en las réplicas técnicas. Al intentar este protocolo, puede haber alguna dificultad con la adición de muestras sin burbujas a la máquina. Para evitar esto, agregue aire y agua a la máquina y luego agregue muestras lentamente.
Además, asegúrese de monitorear continuamente sus muestras y que no haya burbujas presentes. Este nuevo método será probado en individuos con enfermedad de la piedra de riñón del oxalato del calcio para supervisar la progresión de la enfermedad y/o para predecir riesgo de la piedra de riñón.
