Este protocolo permite la purificación de las células T INK, que son muy raras, y permite una expansión de 30 veces en su número. La purificación se puede realizar en un día y producir un gran número de células T INK listas para usar para estudios in vivo e in vitro en dos semanas. Demostrando el procedimiento estará Gloria Delfanti, una post-doc en el laboratorio.
Después de diseccionar el bazo del ratón, aplastarlo a través de un colador celular de 70 nanómetros para obtener una suspensión de una sola célula en 10 mililitros de PBS con 2% FBS. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular con un mililitro de tampón estéril de cloruro de amonio potasio lisina.
Incubar las células durante tres minutos a temperatura ambiente, luego bloquear con cinco mililitros de PBS con 2% FBS. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en tres mililitros de PBS con 2% FBS y elimine los residuos de grasa mediante pipeteo.
Para los pasos de enriquecimiento, mantenga las células frías y use soluciones preenfriadas a cuatro grados centígrados y luego mantenidas en hielo. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. Resuspend todas las células en la cantidad adecuada de PBS con 2% FPS y bloqueador Fc e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Lavar con uno o dos mililitros de tampón de separación MACS por cada 10 millones de células y centrifugar a 300 veces G durante 10 minutos. Después de retirar el sobrenadante, tiñe las células con CD19-FITC y H2-IAb-FITC e incube durante 15 minutos en la oscuridad a cuatro a ocho grados centígrados. Lave las células agregando de uno a dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 90 microlitros de tampón MACS por cada 10 millones de células. Agregue 10 microlitros de microperlas anti-FITC por cada 10 millones de células. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a cuatro a ocho grados centígrados.
Lave las células agregando uno o dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda hasta 125 millones de células en 500 microlitros de tampón MACS. Coloque una columna LD en el campo magnético del separador MACS.
Para evitar obstrucciones, aplique un filtro de preseparación en la columna LD y enjuáguela con dos mililitros de tampón MACS. Aplique la suspensión de celdas sobre el filtro y recoja las celdas sin etiquetar que pasan a través de la columna. Lave el depósito de columna vacío tres veces con un mililitro de búfer MACS.
Recoger el efluente enriquecido con células T y contar las células, manteniendo 50 microlitros para el análisis FACS. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, retire el sobrenadante y manche las células con CD1d tetramer-PE. Mezclar bien e incubar durante 30 minutos en la oscuridad sobre hielo.
Lave las células agregando de uno a dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células. Después de la centrifugación a 300 veces G durante 10 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 80 microlitros de tampón MACS por cada 10 millones de células. Agregue 20 microlitros de microperlas anti-PE por cada 10 millones de células.
Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a cuatro a ocho grados centígrados. Lave las células agregando de uno a dos mililitros de tampón MACS por cada 10 millones de células y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda hasta 100 millones de células en 500 microlitros de tampón MACS.
De acuerdo con el recuento de celdas, coloque la columna LS o MS en el campo magnético del separador MACS y enjuague la columna con el búfer MACS. Aplique la suspensión de celdas sobre la columna, recoja las celdas sin etiquetar que pasan y lave la columna tres veces como se describió anteriormente. Esta es la fracción negativa.
Retire la columna del campo magnético y colóquela en un nuevo tubo de recolección. Búfer MACS de pipete en la columna y empuje el émbolo proporcionado en la columna para eliminar la fracción positiva enriquecida en células T INK. Para aumentar aún más la recuperación de células T ink, centrífuga la fracción negativa a 300 veces G durante 10 minutos y repita los pasos anteriores con una nueva columna LS o MS.
Extraiga las fracciones positivas y determine el recuento de células. Mantenga 50 microlitros de fracciones positivas y negativas para el análisis FACS para verificar la pureza. Para activar las células T INK en una proporción de uno a uno, transfiera el volumen apropiado de perlas magnéticas anti-CD3 y CD28 a un tubo y a un volumen igual de PBS, luego vórtice durante cinco segundos.
Coloque el tubo sobre un imán durante un minuto y deseche el sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las perlas magnéticas lavadas en el volumen adecuado de RPMI. Centrífuga las células T INK purificadas a 300 veces G durante cinco minutos y mézclalas con perlas magnéticas anti-CD3 o CD28 activadoras en T del ratón.
Placa un mililitro de la suspensión celular, perlas magnéticas anti-CD23 y CD28 en una placa de 48 pocillos con 20 unidades por mililitro IL-2, luego incubar a 37 grados Celsius. Después de cinco días, agregue 10 nanogramos por mililitro de IL-7. Divida las células por la mitad cuando alcancen entre el 80 y el 90% de confluencia, siempre añadiendo 20 unidades por mililitro de IL-2 y 10 nanogramos por mililitro de IL-7.
En estas condiciones, las células T INK se pueden expandir hasta por 15 días. Usando este protocolo, las células T INK se enriquecen a partir del bazo de ratones transgénicos a través de un proceso de separación inmunomagnética. Después del enriquecimiento, las células se pueden expandir con perlas anti-CD3 y CD28, lo que resulta en una expansión de 30 veces en promedio para el día 14 del cultivo.
La fuerte activación con perlas anti-CD3 y anti-CD indujo la regulación a la baja de la expresión de TCR de células T IMK en la superficie celular y apareció una población doble negativa. La mayoría de las células T INK expandidas son CD4 negativas. La caracterización de los factores de transcripción específicos del linaje PLZF y ROR gamma T permitió identificar los fenotipos NKT1, NKT2 y NKT17 en células T INK enriquecidas en el día cero y 14.
Las células T INK enriquecidas muestran un fenotipo efector similar al T80, que se conserva después de 14 días de expansión, como lo confirma la secreción de interferón gamma e IL-4 después de la estimulación con PMA e ionomicina. Durante los pasos de purificación, recuerde trabajar rápidamente con soluciones preenfriadas y deshacerse de los residuos de grasa que se puedan ver durante el pipeteo. Las células T INK expandidas se pueden explotar para ensayos in vitro y transferencias in vivo a ratones, incluso después de modificaciones funcionales a través de transferencia o edición de genes.
La expansión in vitro de las células T INK supera la limitación dada por la escasez, haciéndolas explotables en estudios preclínicos en los campos de la vigilancia inmune tumoral, las enfermedades infecciosas y la autoinmunidad.
