Este método proporciona a los investigadores una nueva forma de preparar las raíces de las plantas acuáticas, la rizosfera circundante y el suelo a granel para las técnicas de imagen elemental. La principal ventaja de este método es que es relativamente rápido y asequible, al tiempo que preserva con precisión la distribución y especiación de los elementos de interés. Esta técnica se puede utilizar para responder preguntas sobre muchos elementos y sistemas de plantas, desde nutrientes en sistemas agrícolas hasta el destino y el transporte de contaminantes en sistemas de encadenado.
Asegúrese de trabajar rápidamente y al mismo tiempo tenga en cuenta el área o áreas deseadas del sistema radicular para el muestreo. Y tome múltiples muestras por sistema raíz. Para preparar el equipo de congelación de slam para un experimento, coloque bloques de cobre de dos, cinco por cinco por 15 centímetros horizontalmente en un refrigerador limpio capaz de contener nitrógeno líquido.
Y usando el EPP apropiado, vierta suficiente nitrógeno líquido en el refrigerador para sumergir los bloques. Una vez que el burbujeo disminuya, coloque un espaciador en cada extremo de un bloque de cobre. Luego, usando pinzas y guantes criogénicos, coloque el otro blog de cobre en su extremo para facilitar la recuperación cuando la muestra esté en su lugar.
Para recolectar la muestra, use una planta en maceta o use una pala para comenzar a extraer la planta y la rizosfera deseadas del suelo húmedo, cuidando que el agujero excavado sea mucho más grande que el volumen de raíz deseado. Use una cuchilla de acero para cortar cualquier exceso de tierra, teniendo cuidado de no molestar el suelo dentro del área deseada. Cuando las áreas deseadas alcancen, corte un cubo de raíz de aproximadamente tres por tres por dos centímetros, e inmediatamente coloque el cubo entre los dos espaciadores en el bloque de cobre horizontal.
Para una congelación por golpe de la muestra, use los guantes criogénicos para colocar el bloque de cobre vertical en los espaciadores durante aproximadamente cinco minutos. Cuando el burbujeo disminuye, transfiera la muestra del cubo de rizosfera congelado slam a un trozo de cuadrado de papel de aluminio preetitiqueta. Para secar por congelación los cubos de tierra, cuando el liofilizador haya alcanzado la presión y temperatura de vacío adecuadas, coloque una muestra de cubo de rizosfera congelada para un tubo de 50 mililitros limpio y lavado con ácido o directamente en el liofilizador y use una toallita desechable limpia para evitar que el polvo entre en la bomba de vacío.
Coloque las muestras en el recipiente del liofilizador durante al menos unos días hasta que se sequen. Cuando los tejidos hayan sido liofilizados, use una cuchilla de acero para secar los cubos de suelo a un tamaño apropiado para el análisis antes de colocar los cubos en formas etiquetadas dentro de un desecador al vacío. Después de preparar epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante, use un gotero para agregar lentamente epoxi a la forma en un lado del suelo, hasta que el epoxi cubra completamente la muestra.
El suelo se oscurecerá en color a medida que el epoxi humedece el suelo. Una vez que las formas estén llenas de epoxi, cierre el desecador y encienda el vacío. Verifique el nivel de un epoxi cada 30 a 90 minutos durante las primeras una a cuatro horas, agregando epoxi adicional si es necesario.
Una vez que el epoxi se haya endurecido, retire la muestra. Después de incrustar, use una sierra húmeda de precisión de hoja de diamante para cortar la muestra. Cortar la muestra en una dirección diferente si no se obtienen raíces en el corte anterior.
Después del recorte, lija manualmente el lado cortado de cada muestra con papel de lija progresivamente más fino durante 30 segundos por tamaño de grano. En esta figura, se pueden observar varios diámetros de raíz dentro de la matriz del suelo como secciones transversales. Las raíces pueden demostrar diferentes niveles de calidad.
Por ejemplo, en esta imagen, se puede observar una raíz bien conservada, una raíz distorsionada por el proceso de liofilización y una raíz que se extrayó durante el proceso de sección delgada. El análisis de esta sección transversal de la raíz con una raíz lateral en la sección longitudinal por imágenes de fluorescencia de rayos X sincrotrón como se ha demostrado permite la detección de hierro, manganeso y arsénico. La presencia de hierro dentro del suelo y alrededor de la raíz en la placa de hierro también es visible en las imágenes de micrografía de luz.
El manganeso está presente de manera única dentro de la corteza de la raíz lateral, pero también se co-localiza con el hierro en algunas áreas dentro de la placa de hierro como un tono verde-azul. El arsénico se encuentra principalmente dentro de la vasculatura de la raíz lateral que se fusiona con la vasculatura de la raíz primaria. Las imágenes de especiación química revelan una variabilidad en la localización de las especies de arsénico.
Como se observa en esta gráfica tricolor, el arsenito y el glutatión de arsenito están estrechamente asociados en la vasculatura, mientras que el arseniato se localiza principalmente dentro del exterior de la raíz, asociado con la placa de hierro. Antes de la recolección de muestras, determine la parte deseada del sistema radicular para las imágenes elementales. Esto dictará la orientación de ubicación de la clave raíz eliminada.
Siguiendo este protocolo, las muestras se pueden obtener imágenes a escala micrométrica o más gruesa utilizando una variedad de técnicas, dependiendo de las preguntas de investigación específicas, los elementos de interés o la instrumentación disponible.
