Este protocolo de aislamiento de hepatocitos de rata se basa en la resección hepática antes del enfoque de digestión. El protocolo introduce un sistema de perfusión integrado compacto y portátil para el aislamiento celular. Esta técnica implica la recirculación de la colagenasa que reduce el volumen de uso de la colagenasa y proporciona más flexibilidad en la extensión del tiempo de digestión al tiempo que garantiza un alto rendimiento de gravedad y la función específica de los hepatocitos.
Pon la rata en la capucha. Después de cortar los músculos abdominales, empuje los intestinos hacia la derecha con la parte posterior de las pinzas curvas. Rompa la membrana debajo del conducto biliar con la punta de las pinzas curvas para enrollar la sutura alrededor de la vena porta y el conducto biliar.
Use una sutura quirúrgica de seda para hacer una ligadura muy suelta alrededor de la vena porta cerca del hígado, justo antes de que la vena se ramifique a izquierda y derecha en diferentes lóbulos hepáticos. Alrededor de dos a tres centímetros aguas arriba de la primera ligadura, justo antes de que la vena gástrica se ramifique de la vena porta, crea un agujero a través del tejido debajo de la vena porta con las puntas de dos pares de fórceps curvos. Luego estire el orificio para apoyar la vena porta durante la canulación.
Evite la acumulación de presión en el hígado reduciendo la velocidad de la bomba a cuatro RPM para un caudal de aproximadamente tres mililitros por minuto. Y asegúrese de que la salida del tampón libre de calcio del catéter intravenoso se reduzca a un goteo lento. Mientras apoya suavemente la vena porta con fórceps, sostenga el catéter intravenoso con el bisel de la aguja hacia arriba.
E inserte la aguja en la vena porta en un ángulo de 10 a 20 grados. Luego avance lentamente hasta que todo el bisel esté dentro de la vena. La inserción correcta debe resultar en el escaldado del color del hígado.
Avance la cánula sobre la aguja y retraiga la aguja detrás de la cánula tirando hacia atrás del ala con el dedo índice mientras sostiene el catéter con el pulgar y el dedo medio. Asegure la vena porta en el catéter con un clip de vena y un clip debajo de la vena porta para evitar la interrupción del flujo de perfusión. A continuación, corte la vena cava inferior infrahepática para evitar la acumulación de presión en el hígado y observe los impulsos de chorro de sangre para garantizar el corte correcto.
Aumente la velocidad de la bomba a 38 RPM para un caudal de aproximadamente 33 mililitros por minuto. Y enjuague el hígado tres veces cerrando la vena cava inferior infrahepática con fórceps durante dos o tres segundos, y luego volviéndola a abrir. Para perfundir todos los lóbulos hepáticos, ajuste la posición de la punta de la cánula y asegúrese de que se coloque antes de que la vena porta se ramifique en diferentes lóbulos hepáticos.
Luego, apriete la ligadura suelta alrededor de la vena porta, ligeramente aguas arriba del punto de ramificación, y asegure la posición de la cánula en la vena porta para evitar el reflujo del tampón haciendo tres nudos en el punto donde la aguja dura sostiene la cánula, entre el bisel y el orificio lateral. Después de la resección hepática, permita que el hígado se perfunda con el tampón libre de calcio durante 12 minutos. Luego, apriete la abrazadera del rodillo del tampón libre de calcio y afloje la abrazadera del rodillo del tampón de colagenasa para cambiar el tampón de perfusión.
Después de que el tampón de colagenasa llegue al hígado, enjuague el hígado tres veces cerrando la vena cava inferior suprahepática durante dos o tres segundos y volviéndola a abrir. Mueva cuidadosamente el hígado a la etapa en la parte superior del vaso de precipitados para la recirculación del tampón de colagenasa sosteniendo el diafragma con fórceps mientras apoya el catéter, teniendo cuidado de no tirar del catéter para evitar el desprendimiento accidental. Digiera el hígado durante 12 minutos y detenga la perfusión cuando el hígado pierda su textura marrón lisa y se vuelva blando.
Extender el tiempo de digestión si es necesario. Después de la digestión del hígado, corte la vena porta con cuidado retire la cánula. Y luego transfiera el hígado a DMEM frío para aislar los hepatocitos.
Golpee suavemente el hígado con la parte posterior de las pinzas curvas para romper y despegar la cápsula glistens. Y libere las células hepáticas balanceando suavemente el hígado en DMEM hasta que las células estén completamente disociadas en los medios. La viabilidad de los hepatocitos fue de entre el 88 y el 94,8%, según lo determinado por el trip y el conteo azul.
El rendimiento de los hepatocitos de ratas que pesaban de 200 a 300 gramos fue de hasta cinco veces 10 a las octavas células por aislamiento. Las imágenes representativas muestran suspensión de células hepáticas no purificadas y suspensión de hepatocitos purificados. La pureza de los hepatocitos aislados fue de aproximadamente el 96,8%, que se cuantificó contando las células teñidas fluorescentes positivas con albúmina en relación con el número total de núcleos celulares.
En las imágenes representativas que se muestran en color falso, el verde representa la albúmina, y el azul indica los núcleos celulares con albúmina. Los núcleos celulares sin albúmina están resaltados en rojo. Los hepatocitos en cultivo sándwich formaron distintos canalículos biliares y tuvieron un buen contacto celular.
Como lo demuestran los ensayos de albúmina, urea y citocromo P450, los hepatocitos exhibieron una alta secreción de urea y albúmina. En el tercer día, los hepatocitos exhibieron altas actividades enzimáticas para CYP1A2, CYP2B1/2 y CYP3B2. Prepárese mentalmente antes de insertar la aguja en la vena porta.
Tras la inserción, un cirujano deberá continuar sin pulso hasta que se aumente la velocidad de la bomba después de cortar el IVC.
