Этот протокол выделения гепатоцитов крыс основан на резекции печени до подхода к пищеварению. Протокол представляет компактную и портативную интегрированную перфузионную систему для изоляции клеток. Этот метод включает рециркуляцию коллагеназы, которая уменьшает объем использования коллагеназы и обеспечивает большую гибкость в продлении времени пищеварения, обеспечивая при этом высокий гравитационный выход и специфическую функцию гепатоцитов.
Положите крысу в капюшон. После разрезания мышц живота оттолкните кишечник вправо задней частью изогнутых щипцов. Разорвите мембрану под желчным протоком кончиком изогнутых щипцов для закольцовки шва вокруг воротной вены и желчного протока.
Используйте шелковый хирургический шов, чтобы сделать очень рыхлую лигатуру вокруг воротной вены близко к печени, непосредственно перед тем, как вена разветвляется влево и вправо в разные доли печени. Примерно в двух-трех сантиметрах вверх по течению от первой лигатуры, непосредственно перед тем, как желудочная вена ответвляется от воротной вены, создают отверстие через ткань под воротной веной с кончиками двух пар изогнутых щипцов. Затем растяните отверстие, чтобы поддержать воротную вену во время канюляции.
Предотвратите накопление давления в печени, уменьшив скорость насоса до четырех оборотов в минуту при скорости потока примерно три миллилитра в минуту. И убедитесь, что отток буфера без кальция из внутривенного катетера уменьшается до медленной капельницы. Осторожно поддерживая воротную вену щипцами, удерживайте внутривенный катетер со скосом иглы вверх.
И вставьте иглу в воротную вену под углом от 10 до 20 градусов. Затем медленно продвигайтесь до тех пор, пока весь скос не окажется внутри вены. Правильное введение должно привести к бланшированию цвета печени.
Переместите канюлю над иглой и втяните иглу за канюлю, оттянув крыло указательным пальцем, удерживая катетер большим и средним пальцем. Закрепите воротную вену на катетере с помощью зажима вены и зажмите под воротной веной, чтобы избежать нарушения перфузирующего потока. Затем отрежьте инфрахепатическую нижнюю полую вену, чтобы предотвратить накопление давления в печени, и наблюдайте за импульсами, брызгающими кровью, чтобы обеспечить правильный разрез.
Увеличьте скорость насоса до 38 об/мин при скорости потока около 33 миллилитров в минуту. И промыть печень три раза, закрыв инфрахепатическую нижнюю полую вену щипцами на две-три секунды, а затем вновь открыв ее. Для того чтобы перфузировать все доли печени, отрегулируйте положение кончика канюли и убедитесь, что она размещена перед тем, как воротная вена разветвляется на разные доли печени.
Затем затяните свободную лигатуру вокруг воротной вены, немного выше по течению от точки ветвления, и закрепите положение канюли в воротной вене, чтобы предотвратить обратный поток буфера, сделав три узла в точке, где твердая игла поддерживает канюлю, между скосом и боковым отверстием. После резекции печени дайте печени перфузировать с буфером без кальция в течение 12 минут. Затем затяните роликовый зажим буфера без кальция и ослабьте роликовый зажим коллагеназного буфера, чтобы изменить буфер перфузии.
После того, как коллагеназный буфер достигнет печени, промывайте печень три раза, закрывая супрахепатическую нижнюю полую вену на две-три секунды и вновь открывая ее. Осторожно переместите печень в стадию поверх стакана для рециркуляции буфера коллагеназы, удерживая диафрагму щипцами, поддерживая катетер, следя за тем, чтобы не тянуть катетер, чтобы предотвратить случайное отслоение. Переваривайте печень в течение 12 минут и прекращайте перфузию, когда печень теряет свою гладкую коричневую текстуру и становится кашицеобразной.
При необходимости продлите время пищеварения. После переваривания печени разрезают воротную вену, аккуратно удаляют канюлю. А затем перевести печень в холодный ДМЭМ для выделения гепатоцитов.
Осторожно постучите по печени, используя заднюю сторону изогнутых щипцов, чтобы сломать и отклеить капсулу блеска. И высвобождайте клетки печени, мягко раскачивая печень в DMEM до тех пор, пока клетки не будут полностью диссоциированы в среде. Жизнеспособность гепатоцитов составляла от 88 до 94,8%, что определялось трипом и синим подсчетом.
Выход гепатоцитов у крыс весом от 200 до 300 граммов составлял до пяти раз по 10-восьмым клеткам за выделение. На репрезентативных изображениях показана неочищенная суспензия клеток печени и очищенная суспензия гепатоцитов. Чистота выделенных гепатоцитов составляла приблизительно 96,8%, что было количественно определено путем подсчета альбумин-положительных флуоресцентных окрашенных клеток по отношению к общему числу клеточных ядер.
На репрезентативных изображениях, показанных ложным цветом, зеленый представляет альбумин, а синий указывает на клеточные ядра с альбумином. Ядра клеток без альбумина выделены красным цветом. Гепатоциты в сэндвич-культуре образовывали отчетливые желчные канальцы и имели хороший клеточный контакт.
Как показали анализы альбумина, мочевины и цитохрома Р450, гепатоциты демонстрировали высокую секрецию мочевины и альбумина. На третий день гепатоциты продемонстрировали высокую ферментную активность для CYP1A2, CYP2B1/2 и CYP3B2. Будьте морально подготовлены перед введением иглы в воротную вену.
После введения хирургу нужно будет продолжать без импульса, пока скорость насоса не будет увеличена после разрезания IVC.
