이러한 래트 간세포 분리 프로토콜은 소화 접근법 이전의 간 절제술에 기초한다. 이 프로토콜은 세포 분리를 위한 콤팩트하고 휴대용 통합 관류 시스템을 도입합니다. 이 기술은 콜라게나제 재순환을 수반하여 콜라게나제 사용의 부피를 줄이고 높은 중력 수율과 간세포 특이적 기능을 보장하면서 소화 시간을 연장하는 데 더 많은 유연성을 제공합니다.
쥐를 후드에 넣으십시오. 복부 근육을 절단 한 후 구부러진 집게의 뒤쪽으로 창자를 오른쪽으로 밀어 넣으십시오. 담관 아래의 막을 구부러진 포셉의 끝으로 부수어 포털 정맥과 담관 주위의 봉합사를 반복하십시오.
실크 외과 봉합사를 사용하여 정맥이 좌우로 다른 간 엽으로 들어가기 직전에 간에서 가까운 포털 정맥 주위에 매우 느슨한 합자를 만드십시오. 위 정맥이 포털 정맥에서 분기하기 직전에 첫 번째 합자의 상류에서 약 두 세 센티미터 떨어진 곳에 두 쌍의 곡선 포셉 팁이있는 포털 정맥 아래의 조직을 통해 구멍을 만듭니다. 그런 다음 구멍을 뻗어 캐뉼레이션 중에 포털 정맥을지지하십시오.
분당 약 세 밀리리터의 유속으로 펌프 속도를 네 RPM으로 줄임으로써 간에서 압력 축적을 방지합니다. 정맥내 카테터로부터의 칼슘 프리 버퍼의 유출이 느린 드립으로 감소되도록 보장한다. 포셉으로 문맥 정맥을지지하면서 바늘의 경사가 위를 향하게하여 정맥 내 카테터를 잡으십시오.
바늘을 10 내지 20도 각도로 포털 정맥에 삽입한다. 그런 다음 전체 경사가 정맥 안에있을 때까지 천천히 진행하십시오. 올바른 삽입은 간 색의 블랜칭을 초래해야합니다.
캐뉼라를 바늘 위로 전진시키고 엄지와 가운데 손가락으로 카테터를 잡고있는 동안 검지 손가락으로 날개를 뒤로 당겨 캐뉼라 뒤의 바늘을 수축시킵니다. 정맥 클립으로 포털 정맥을 카테터에 고정시키고 포털 정맥 아래에 클립하여 흐름 중단을 방지하십시오. 다음으로, 간에서 압력이 축적되는 것을 막기 위해 infrahepatic 열등한 정맥 카바를 자르고 올바른 절단을 보장하기 위해 혈액 박차를 가하는 충동을 관찰하십시오.
분당 약 33밀리리터의 유량에 대해 펌프 속도를 38RPM으로 높입니다. 그리고 두세 초 동안 포셉으로 infrahepatic 열등한 정맥 카바를 닫은 다음 다시 열어 간을 세 번 씻어냅니다. 모든 간 엽을 관류하려면 캐뉼라 팁의 위치를 조정하고 포털 정맥이 다른 간 엽으로 분기하기 전에 배치되었는지 확인하십시오.
그런 다음 분기점의 약간 상류에있는 포털 정맥 주위의 느슨한 합자를 조이고 경질 바늘이 캐뉼라를지지하는 지점, 베벨과 측면 구멍 사이의 세 매듭을 만들어 버퍼의 역류를 방지하기 위해 포털 정맥에서 캐뉼라의 위치를 고정하십시오. 간 절제술 후 간이 12 분 동안 칼슘이없는 완충액으로 관류하도록하십시오. 그런 다음 칼슘이없는 버퍼의 롤러 클램프를 조이고 콜라게나제 버퍼의 롤러 클램프를 풀어 관류 버퍼를 변경하십시오.
콜라게나제 완충액이 간에 도달한 후, 초라게파틱 열등한 베나 카바를 두세 초 동안 닫고 다시 열어 간을 세 번 플러시합니다. 카테터를지지하면서 포셉으로 횡격막을 잡고 콜라게나제 버퍼의 재순환을 위해 비커의 상단에있는 무대로 간을 조심스럽게 옮기고 카테터를 당기지 않도록주의하여 우발적 인 박리를 방지하십시오. 간을 12 분 동안 소화하고 간이 부드러운 갈색 질감을 잃고 근육질이 될 때 관류를 중단하십시오.
필요한 경우 소화 시간을 연장하십시오. 간장의 소화 후 포털 정맥을 조심스럽게 잘라 캐뉼라를 제거하십시오. 그런 다음 간을 차가운 DMEM으로 옮겨 간세포를 분리합니다.
구부러진 포셉의 뒷면을 사용하여 간을 부드럽게 두드려 반짝이는 캡슐을 부수고 벗겨냅니다. 세포가 배지에서 완전히 해리될 때까지 DMEM에서 간을 부드럽게 흔들어 간 세포를 방출한다. 간세포의 생존율은 트립과 블루 카운팅에 의해 결정된 바와 같이 88 내지 94.8% 사이였다.
체중이 200 내지 300 그램인 래트로부터의 간세포의 수율은 단리당 10 내지 여덟 번째 세포의 다섯 배에 달하였다. 대표적인 이미지는 정제되지 않은 간세포 현탁액과 정제된 간세포 현탁액을 보여준다. 분리된 간세포의 순도는 약 96.8%였으며, 이는 세포핵의 총 수와 관련하여 알부민 양성 형광 염색된 세포를 계수하여 정량하였다.
오색으로 표시된 대표적인 이미지에서, 녹색은 알부민을 나타내고, 파란색은 알부민이 있는 세포핵을 나타낸다. 알부민이없는 세포 핵은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 샌드위치 배양물에서 간세포는 뚜렷한 담즙 canaliculi를 형성하고, 좋은 세포 세포 접촉을 가졌다.
알부민, 우레아 및 시토크롬 P450 분석법에 의해 나타난 바와 같이, 간세포는 높은 우레아 및 알부민 분비를 나타내었다. 셋째 날에, 간세포는 CYP1A2, CYP2B1/2 및 CYP3B2에 대해 높은 효소 활성을 나타내었다. 포털 정맥에 바늘을 삽입하기 전에 정신적으로 준비하십시오.
삽입시 외과 의사는 IVC를 절단 한 후 펌프 속도가 증가 할 때까지 펄스없이 계속해야합니다.
