El software automated Detection and Analysis Of Exocytosis permitirá al usuario detectar automáticamente eventos exocíticos y secuencias de imágenes TIRF de fluoróforos sensibles al pH. También producirá automáticamente características de la exocitosis, como la distribución espacial o la frecuencia, así como propiedades individuales de eventos exocíticos, como la vida media o el cambio en la fluorescencia sobre el fondo. Además, se incluye una opción para clasificar los eventos exocióticos en cuatro modos de exocitosis, previamente descritos en la literatura.
Para utilizar el software de detección y análisis automatizado de exocitosis, primero hará clic en el botón Buscar conjunto de datos y navegará hasta donde se depositan sus datos, y querrá colocar una carpeta llamada datos sin procesar. Sus archivos de datos rellenarán automáticamente la lista aquí, y puede tener cualquier número de archivos de datos en esta carpeta. A continuación, querrá elegir un directorio para el que se depositarán sus archivos de análisis.
Aquí, he elegido un directorio llamado test. También querrá completar la velocidad de fotogramas de sus imágenes, así como el tamaño de píxel. Aquí mis velocidades de fotogramas son de cien milisegundos por fotograma, mi tamaño de píxel es de ocho nanómetros.
Finalmente, necesitará archivos de máscara para ejecutar el software de detección y análisis automatizado de exocitosis. Puede utilizar el botón de creación de máscaras incluido para generar automáticamente archivos de máscaras a partir de sus archivos de datos. El indicador de ejecución se volverá amarillo y luego volverá a verde cuando el fabricante de máscaras termine de funcionar.
Su máscara se depositará en una nueva carpeta llamada archivos de máscara en el directorio elegido. Y tenga en cuenta que los archivos de máscara rellenarán automáticamente la lista aquí. Querrá verificar que sus archivos de máscara estén hechos adecuadamente para sus archivos de datos, y puede hacerlo resaltando cualquiera de los archivos de datos en la lista, así como el archivo de máscara correspondiente.
Aparecerá el primer fotograma de su archivo de datos y también aparecerá el archivo de máscara seleccionado. Aquí. Podemos ver que nuestros archivos de máscara son apropiados para el análisis en cuestión. Los archivos de máscara también pueden ser suministrados por el usuario por separado.
Cuando uno desea hacer un archivo de máscara a partir de un archivo de datos actual, le recomendamos que utilice Image J.In para hacerlo, primero abra la imagen en Image J a partir de la que desea crear un archivo de máscara. A continuación, puede utilizar la herramienta de selección de polígonos para comenzar a crear un archivo de máscara haciendo clic alrededor del borde de la celda. Cuando haya completado la máscara, haga doble clic para conectarse a todo el polígono.
Una vez que esto se haya completado, se dirigirá a editar, seleccionar y crear máscara. Se creará una máscara invertida. Querrá guardar este archivo de máscara con el mismo nombre que el archivo de datos seguido de _mask_file.
Ahora, si proporciona sus propios archivos de máscara personalizados, es importante que el software de detección automatizada sepa dónde se encuentran esos archivos de máscara. Para hacerlo, hará clic en el botón Buscar archivos de máscara y navegará hasta el directorio con sus archivos de máscara en él. Los nuevos archivos de máscara rellenarán la lista aquí.
Es importante que tenga una máscara para cada archivo de datos antes de que se pueda ejecutar el análisis. Ahora, una vez que haya cargado su conjunto de datos, sus archivos de máscara, su velocidad de fotogramas y tamaño de píxel ajustado correctamente, y un directorio elegido, finalmente puede decidir si desea incluir la clasificación como parte de su análisis. Si alterna el botón de clasificación, además de detectar eventos exocióticos, cada evento exocítico se clasificará en una de las cuatro clases.
Una vez que haya decidido la forma en que se ejecutará su análisis, puede comenzar el análisis haciendo clic en el botón de análisis. El indicador de ejecución se volverá amarillo para indicar que el análisis está en curso y volverá a verde cuando finalice el análisis. Una vez que se complete el análisis, como lo indica el indicador de ejecución que cambia de amarillo a verde, notará que ha aparecido una nueva carpeta de archivos de datos dentro del directorio elegido.
Dentro de la carpeta de archivos de datos, encontrará archivos de análisis correspondientes a cada conjunto de imágenes en su ejecución de análisis. Además, aquí se encuentra un archivo de estadísticas celulares que contiene información resumida, como la frecuencia de exocitosis para cada uno de los conjuntos de imágenes. Para cada conjunto de imágenes, tiene un archivo de trazas fluorescentes, que contiene información sobre la posición X, la posición Y y el número de fotograma para el lugar donde se producen los eventos exocitarios.
Además, la fluorescencia media en una región de interés alrededor de cada evento exocítico se presenta tanto antes, durante y después de la exocitosis. Además, también hay un archivo de seguimiento, que contiene información similar de las posiciones X, Y y temporal. Sin embargo, si la casilla de verificación de clasificación está marcada, además, habrá cuatro columnas adicionales, que indican la probabilidad de que el evento exocítico pertenezca a una de las cuatro clases.
Fusión de vesícula completa instantánea, fusión de vesícula completa retrasada, instantánea de beso y corrido o retraso de beso y corrida. Un evento exocítico pertenece a una de las cuatro clases si es mayor que 0,5 y es la probabilidad más alta dentro de las cuatro clases gobernadas. En este caso, el primer evento exocítico aquí pertenece a la clase instantánea de fusión de vesículas completas, ya que es el número más alto por encima de las cuatro clases y es mayor que 0.5.
Además, hay una serie de otros archivos de características para cada conjunto de imágenes, que se utilizan durante la clasificación de la exocitosis y pueden ser de interés para un análisis posterior. Finalmente, si queremos utilizar el análisis K de Ripley para detectar la organización espacio-temporal de la exocitosis, primero comenzaremos dividiendo nuestro archivo de máscara en un archivo de máscara de neurita y un archivo de máscara de soma. Haremos esto abriendo primero nuestra máscara en la imagen J.Querremos usar el selector de color para seleccionar un píxel de fondo.
Y de esta manera, cuando rellenamos el archivo de máscara, es el valor correcto. A continuación, usaremos la herramienta de selección de polígonos y describiremos la región somática. Ahora bien, esto requiere un poco de toma de decisiones subjetiva y manual.
sugerimos un elipsoide áspero. Una vez que haya completado eso, irá a editar, seleccionar y crear máscara. Finalmente, volverá a nuestro archivo de máscara original y usará editar y completar para completar el soma, y ahora tenemos un archivo de máscara de neurita y soma separado, que luego guardará.
Una vez que haya guardado su archivo separado de neurita y máscara de soma, aquí, lo tengo como neur de subrayado de archivo de máscara para neurita y soma de subrayados, iremos a MATLAB y abriremos el archivo MATLAB de red 2D de neurita. Aquí, navegaremos por la carpeta actual a nuestro directorio donde depositamos todos nuestros datos de análisis. Una vez que hayamos hecho eso, haremos cambiado la ruta del nombre de la máscara a nuestro nuevo archivo de máscara que es la neurita.
Entonces, en este caso, tengo mi archivo de máscara de neurita debajo de la carpeta de archivos de máscara. Luego cambiaremos el nombre del archivo CSV a donde se encuentra nuestro archivo de rastros fluorescentes. En este caso, todavía está en la carpeta de archivos de datos, por lo que los archivos de datos se cortan y el nombre del archivo CSV de trazas fluorescentes.
Una vez que se haya completado, puede presionar ejecutar. Esto creará una versión esqueletizada del archivo de máscara de neurita y lo depositará como un archivo CSV en la carpeta de archivos de máscara, que podemos ver aquí. A continuación, también generaremos un archivo CSV para el soma.
Para ello, abra el archivo de creación de máscaras CSV. Querrás poner la ruta de tu máscara soma y un nombre para el archivo CSV que se creará. Aquí seguí adelante y usé el mismo nombre de archivo exacto, solo que con el punto CSV adjunto.
Presione ejecutar y verá que se ha creado un nuevo archivo CSV soma junto con la neurita. Una vez que hemos creado los archivos CSV tanto para la máscara de neurita como para la máscara de soma, podemos ejecutar el análisis K de Ripley. Para hacerlo, navegaremos a R Studio y abriremos el archivo R de análisis K de Ripley.
Hay dos variables principales aquí a las que prestar atención, la máscara neuronal y los puntos de datos neuronales. Neuron mask apuntará a los archivos de máscara que desee ejecutar. En este caso, primero estoy ejecutando los archivos de máscara de soma.
Querrá ejecutar todos sus archivos de máscara de soma por separado de todos sus archivos de máscara de neurita. Aquí, tengo dos neuronas, que usaré para este análisis. Sin embargo, puede usar tantos como desee para el análisis K de Ripley, solo querrá copiar y pegar este código para la máscara neuronal y cambiar la variable a tres, y en adelante.
La segunda variable son los puntos de datos neuronales. Aquí desea apuntarlo al archivo que fue generado por sus características todas las características del archivo R extraído. Ahora el mío se llamaba estadísticas de fusión, y eso es lo que está leyendo aquí.
Como se mencionó, tengo un segundo archivo de máscara de soma y una neurona, que se está analizando junto con para que podamos agregar la K de Ripley. Una vez que haya cambiado estas rutas a la ruta correcta, usará código, ejecutará la región y ejecutará todo. Una vez completada la ejecución, se generarán varias gráficas, incluidos los valores K de Ripley agrupados, así como las gráficas de densidad.
Estos se pueden guardar yendo a exportar, guardar la imagen como y eligiendo el formato de imagen apropiado, el directorio, el nombre del archivo y, finalmente, presionando guardar. Aquí vemos resultados representativos de 12 neuronas corticales murinas que expresan ventilación a flúor fotografiado a los dos días in vitro utilizando microscopía TIRF. En A, vemos la frecuencia de exocitosis dividida por clase.
Aquí podemos ver que la fusión completa de vesículas instantánea ocurre con más frecuencia que las otras clases. En B, podemos ver la distribución de modos, confirmando que la fusión instantánea de vesículas completas constituye más de la mitad de todos los eventos. En C determinamos la distribución espacial de la exocitosis como mapa de calor.
Podemos ver que la mayoría de los eventos exocióticos se agrupan en un punto caliente cerca del soma, así como en los extremos distales de las neuritas. En D podemos determinar que los eventos exocíticos están agrupados estadísticamente significativamente, y que el tamaño de estos grupos varía de media micra a una micra de tamaño. El uso de un programa de análisis automatizado para identificar y analizar correctamente los eventos exocióticos de manera imparcial aumenta la eficiencia del análisis y mejora la reproducibilidad y el rigor.
Para garantizar la precisión de la detección, es importante mantener una señal alta al ruido durante la obtención de imágenes. La captura de eventos exocióticos u otros eventos transitorios sensibles al pH requiere una frecuencia de imagen lo suficientemente rápida como para capturar todos los eventos y mejorar las estimaciones, como la vida media o el cambio máximo en la fluorescencia. Hemos demostrado que este programa no solo funciona para capturar con precisión la fluorescencia sensible al pH en las neuronas en desarrollo, sino también en otros tipos de células.
Sin embargo, si se utiliza otro tipo de célula, es importante comprobar las diferencias en la precisión, debido a los distintos comportamientos de los eventos transitorios en otros tipos de células. Esta clasificación solo se ha utilizado en neuronas en desarrollo hasta la fecha. Y, de hecho, no sabemos que estos procesos existen en otros tipos de células o en puntos de tiempo de desarrollo posteriores en las neuronas.
