KO y AC son apoyados por una beca y beca a de la Asociación Americana del Corazón. SIB y RB son apoyados por las subvenciones del NIH.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">Haga clic aquí para ver un resumen de los semi automatizado de análisis latido del corazón (SOHA) procedimiento.</a> Semi-automatizado de análisis óptico de latidos del corazón 1. Preprocesar - Este paso ofrece información sobre los diámetros cardíaca diastólica y sistólica. Los bordes del corazón son identificados y marcados durante la diástole y la sístole máxima. Grabaciones ópticas se puede avanzar a baja velocidad e incluso un cuadro a la vez que permite la identificación precisa de los marcos donde la máxima contracción y relajación del corazón se producen. Un par de marcas de identificación de los bordes diastólica y un par la identificación de los bordes sistólica se hacen. Las marcas también se puede hacer en dos ejemplares en diferentes lugares a lo largo de la horizontal del corazón. Los diámetros de corazón obtenido en esta etapa también se utilizan para calcular una medida adicional que proporciona una estimación de la contractilidad del corazón. Esta medida es el acortamiento fraccional por ciento (% FS) y representa el grado en que los bordes del corazón se mueven una hacia la otra durante una contracción. La fórmula utilizada para calcular FS% es: (((Diámetro diastólico - diámetro sistólico) / diámetro diastólico) x 100) Nota - Los puntos identificados en este grupo sólo se utilizan para las mediciones de diámetro y fraccionada acortamiento y no se utilizan para la detección de movimiento. Ejemplo: (. Cammarato, et al 2008) En Drosophila, mutaciones puntuales en el dominio del transductor de la cadena pesada de la miosina, una región conocida para modular la actividad enzimática del motor, resultado en los corazones que se dilatan o restringido en función de si se suprimen o aumentan la actividad miosina de ATPasa . Este tipo de medidas no se pueden hacer en las moscas intacta, ya que generalmente no es posible identificar a los bordes del corazón a lo largo de toda la longitud del tubo de corazón a través de la cutícula y la grasa, (compare tipo salvaje, D45 y Mhc5 M-modos en &quot;modo-M La figura &quot;más abajo) que normalmente rodean el corazón. Las mediciones realizadas en la visualización del corazón en las moscas intacta con otros métodos comúnmente empleados son por lo general limitada a la porción más anterior del corazón, la región cámara cónica. Tampoco es posible obtener esta medición dinámica en el tejido fijado. 2. Detección de Movimiento- Este paso se realiza automáticamente por el programa y usa dos algoritmos diferentes para analizar el movimiento de cada película. En pocas palabras, el primer algoritmo, el &quot;Darkness Media Frame&quot; algoritmo utiliza un marco de enfoque del marco. Esto da un promedio algoritmo de la intensidad de la oscuridad de un marco de toda la película, se normaliza el valor de un intervalo entre 0 y 1, y las parcelas de la media normalizada para cada fotograma de la película a través del tiempo. El segundo enfoque, el &quot;pixel por pixel&quot; algoritmo, analiza el cambio en la oscuridad de todos los píxeles individuales de un fotograma a otro. Los píxeles que muestra los cambios de intensidad por encima de un umbral predeterminado se suman para cada fotograma y se representa para cada fotograma de la película a través del tiempo. 3. Intervalos de comprobar- La salida de los dos algoritmos de detección de movimiento se muestra en este módulo con la &quot;oscuridad promedio&quot; de salida en una ventana por encima del &quot;pixel por pixel&quot; ventana de salida. Con el fin de estar seguros de que los intervalos de detección de acuerdo con el movimiento en la película actual que muestra un borde de seguimiento o en modo M a partir de los marcos que se analiza directamente debajo de las ventanas algoritmo de salida. El modo M se realiza digitalmente cortar rodajas de un píxel de ancho a través del corazón de cada fotograma de la película y su alineación horizontal para proporcionar una instantánea de los movimientos del corazón ventaja en el tiempo. En el &quot;pixel por pixel&quot; ventana de los intervalos identificados diastólica se indican mediante una línea horizontal verde con el número de fotogramas que contribuyen a que el intervalo situado encima. Intervalos sistólica se identifican como el intervalo entre dos sucesivas diástoles. El comienzo de una sístole se indica en el modo M por una línea vertical azul y al final se indica con una línea roja vertical. Con esta pantalla es relativamente fácil de ver si la salida del algoritmo está de acuerdo con los movimientos del corazón real. Aunque la detección de movimiento se realiza de forma automática la salida debe ser verificada. Hay varias razones para esto: una es que a menudo hay una fluctuación de base, ondas lentas en los niveles de luz no están relacionadas con el movimiento del corazón. Esto se puede eliminar mediante el uso de una construida en filtro de paso alto. Una segunda razón tiene que ver con la sensibilidad del &quot;pixel por pixel&quot; enfoque. La salida de este algoritmo suele ser de dos huellas movimiento, uno para el movimiento de contracción y otra para el movimiento de relajación. En las moscas y los mayores en algunos mutantes de la longitud de tiempo entre estos dos movimientos<html> llega a ser relativamente larga y el programa trata de interpretar los dos movimientos como dos ritmos diferentes. Esto se puede corregir haciendo el programa para comparar la salida del pixel por pixel con el algoritmo del algoritmo marco oscuridad media, haciendo clic en la &quot;oscuridad utilizar&quot;. Ejemplo (ver video): de 5 a 7 semanas de edad, las moscas de los intervalos sistólica suelen ser mucho más largo que en las moscas de los jóvenes. Estos intervalos de tiempo se detectan inicialmente como dos contracciones separados por un diástole corta. Esto se puede corregir mediante la selección de la &quot;oscuridad uso&quot; casilla de verificación. En este caso, el programa comparará el intervalo diastólico identificados por el pixel por pixel algoritmo con la salida de Marco oscuridad media. Si la salida de Marco oscuridad promedio tiene un valor positivo, entonces cualquier intervalo diastólico identificados en el pixel por pixel algoritmo se tendrá en cuenta y los intervalos se ha especificado correctamente. Toda la película se pueden explorar en 10 segmentos segundo y aceptados (haga clic en &quot;Aceptar datos&quot;) o rechazar (haga clic en &quot;Eliminar datos&quot;). La alta sensibilidad y Lo filtro de paso se pueden ajustar manualmente para ayudar a definir con mayor precisión los intervalos de contracción cuando se emplea el algoritmo de la Oscuridad. 4. Estadísticas de salida Una vez que la salida de una película determinada ha sido aceptada, el programa utilizará esa información para calcular de forma automática una serie de parámetros. Estos incluyen intervalo diastólico y sistólico, el período y la frecuencia cardíaca, la dirección y velocidad de la onda de contracción FS, diámetro del corazón, y%. Además, el programa cuenta con múltiples métodos para la cuantificación de arrhythmicity refleja no uniforme y los ciclos de contracción relajación (ver Fink et al, 2009). Producción estadística es proporcionada por cada película de forma individual y para el conjunto completo de datos en forma de valores separados por comas (. Csv) que se puede abrir en programas de hojas de cálculo como Microsoft Excel. Tabla 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="tabla1" /> Un ejemplo de la salida generada por el semi-automatizado programa de análisis óptico del corazón. 5. Actualización de histogramas- Esta parte del programa muestra todos los datos en intervalos de corazón por un conjunto de datos en formato de histograma. Dado que la frecuencia cardíaca son variables que normalizar los datos de salida del histograma. Sin embargo, debido a la distribución de los intervalos que no es simétrica alrededor de una media que utilizar el valor de la mediana del intervalo de nuestra normalización. Ejemplo (ver video): Las moscas que son mutantes para el canal de potasio KCNQ mostrar intervalos diastólica y sistólica muy irregular. Normalmente los intervalos de presión sistólica es mucho más largo y más irregular que en la misma edad moscas de tipo salvaje. Esto puede verse claramente al mostrar los datos en formato de histograma (véase también Ocorr et al. 2007). 6. M-mode- Este módulo genera M-modos que se pueden hacer desde cualquier posición a lo largo del corazón en el marco de la película. La longitud de la M-modo también se puede especificar. M-modos son útiles para mostrar cualitativamente lo que el corazón está haciendo en una película. Ejemplo (ver video): Película de un corazón del pez cebra 3 días de edad larval mostrando el ventrículo anterior que se utiliza para generar un modo-M. El corte vertical de píxeles que se extirpa de forma electrónica a cada fotograma de la película se indica mediante una línea roja. En modo M Figura: Ejemplos de M-modos de Drosophila y pez cebra. Una de las mutaciones miosina discutido en los resultados de preproceso paso en un motor molecular con la cinética de enzimas más rápido que resulta en la restricción del corazón y de vez en cuando un bloqueo de conducción. Ambos parámetros se pueden mostrar cualitativamente mediante la M-modos. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M-modos de ejemplos" /> M-modos de hecho en la misma porción del corazón en ambos de tipo salvaje y las moscas mutantes que muestran claramente el fenotipo restringido en el MHC 5 mutantes y los diámetros de dilatación y contracción de los ciclos de arritmia del mutante D45 (que expresa la miosina con la cinética de enzimas depresión) (modificado de Cammarato et. al, 2008). En modo M a partir de un corazón larvas de pez cebra que muestra el ventrículo anterior (película de mismo corazón, como se muestra en la manifestación, Fink et.al. 2009). 7. Red Dot Movie- Este módulo genera automáticamente un frenado (1:4), 20 la segunda versión de una película que muestra analizada todos los píxeles que se identifican como el cambio de color rojo. Esta característica se utiliza principalmente para fines de ilustración. Movie 1 - Una &quot;película punto rojo&quot; que muestra los píxeles que están identificadas como de los cambios de intensidad la oscuridad por los algoritmos del programa en rojo. La velocidad de la película se hace más lenta de la original por un factor de 4. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; Haga clic aquí para descargar la película 1. 8. Aplicaciones adicionales- Hemos comenzado a aplicar este sistema de análisis de películas de alta velocidad de otros modelos con pequeños corazones que a menudo son difíciles de analizar utilizando la metodología tradicional. Hemos aplicado con éxito este análisis a los dos corazones larvas de pez cebra y en los corazones de embriones de ratón (Fink et al, 2009). Movie 2 - película del ratón corazón, más la figura con los intervalos de chequeo con salida de datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">Haga clic aquí para descargar la película 2.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="Compruebe los intervalos de ratón del corazón" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El modelo de Drosophila ha demostrado ser una potente herramienta genética que se ha utilizado para tratar una variedad de problemas científicos que van desde el desarrollo embrionario para el aprendizaje y la memoria. Recientemente, este organismo modelo versátil se ha utilizado para investigar la genética de la función cardíaca. Un número de intentos de cuantificar la fisiología del corazón en adultos de Drosophila se han basado en observaciones realizadas en las moscas intacta a través de la cutícula abdom...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

Hemos desarrollado un método para el análisis de grabaciones de alta velocidad óptica de<em&gt; Drosophila</em&gt;, El pez cebra y en los corazones de embriones de ratón (Fink, et. Al., 2009). Nuestros semi-automático de análisis latido óptico (SOHA) utiliza un algoritmo de detección de movimiento nuevo que es capaz de detectar los movimientos cardiacos asociados con cada contracción y relajación eventos. El programa ofrece una serie de lecturas fisiológicamente relevantes, incluyendo sistólica y diastólica, intervalos, ritmo cardíaco, así como las medidas cualitativas y cuantitativas de arrhythmicity latido del corazón. El programa también calcula las mediciones de diámetro de corazón durante tanto diástole y sístole de la cual se calcula la fracción de acortamiento fraccional y los cambios de zona. La salida se proporciona como un archivo digital compatible con la mayoría de los programas de hoja de cálculo. Las mediciones se realizan para cada latido del corazón en un registro de aumentar la potencia estadística de la salida. Se demuestra cada uno de los pasos que se requiere entrada del usuario y mostrar la aplicación de nuestra metodología para el análisis de la función cardíaca en los tres modelos del corazón genéticamente tratable.

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Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Hemos desarrollado un método semi-automatizado de análisis óptico Heartbeat (SOHA) para el análisis de grabaciones de alta velocidad óptica de<em&gt; Drosophila</em&gt;, El pez cebra y en los corazones de embriones de ratón. Se demuestra la aplicación de nuestra metodología para el análisis de la función cardíaca en mosca de la fruta y los corazones de embriones de ratón.

Semi-automatizado de análisis óptico latido de los corazones pequeños

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K vistas.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. Hemos desarrollado un método semi-automatizado de análisis óptico Heartbeat (SOHA) para el análisis de grabaciones de alta velocidad óptica de Drosophila, El pez cebra y en los corazones de embriones de ratón. Se demuestra la aplicación de nuestra metodología para el análisis de la función cardíaca en mosca de la fruta y los corazones de embriones de ratón.

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Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Limpieza y cuidado apropiado del microscopio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Investigación

Biología

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Los componentes principales del microscopio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase y de interferencia diferencial microscopía de contraste (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Sustrato Generación para endonucleasas de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Un Plugin para ImageJ Semi-automático Medición Hoja Forma

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Aislamiento de cardiomiocitos de corazones fijos para inmunocitoquímica y análisis de ploide

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

Análisis cuantitativo de las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos mediante pinzas ópticas y microscopía desenfocada

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Aislamiento semiautomatizado de tejido adiposo blanco murino

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor destacado: Aislamiento semiautomatizado de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo blanco murino mediante un disociador de tejidos  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...