Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención EY 14990.

Parte 1: La disección y aislamiento de células bipolares <ol><li> Preparar las soluciones en la Tabla 2, el pH de timbres &quot;(externo) de soluciones debe ajustarse a 7,4 con NaOH y el pH de la solución interna debe ser ajustado a 7,2 con CsOH. Proteja la solución interna de la luz con papel de aluminio y conservar a 4 ° C hasta su uso; </li><li> Dark-un pez de colores para adaptarse al menos 30 minutos antes de la disección; </li><li> Mientras que el animal se adapta oscuro, preparar 5 ml de la hialuronidasa (tipo hialuronidasa V, 1100 unidades / ml de bajo Ca 2 + de Ringer, Sigma, St. Louis, MO) y 10 ml de la L-cisteína (0,5 mg / ml en el bajo Ca 2 +) del timbre de soluciones y sopesar la papaína (polvo liofilizado, 40 unidades / ml, Sigma, St. Louis, MO) de 5 ml de la solución de digestión; </li><li> La eutanasia de los peces de colores por decapitación rápida con tijeras quirúrgicas y destruir el cerebro y la médula espinal con una hoja de bisturí # 11; </li><li> Quitar los ojos por la destrucción de los músculos extraoculares con la ayuda de unas pinzas Dumont # 7 curvas y el corte del nervio óptico con tijera iris; </li><li> Colocar un ojo bulbo en un pedazo de papel de filtro y perforar el limbo escleral con la punta de una hoja de bisturí # 11; </li><li> Introducir la hoja de un par de tijeras Vannas en el conjunto del pinchado y cortado el segmento anterior conjunto de distancia; </li><li> Coloque un pedazo pequeño de papel de filtro en la parte superior de la copa óptica restantes y ejercer presión a fin de que el papel empape con humor vítreo; </li><li> Levante el papel de filtro con la retina que se le atribuye y cortar el nervio óptico con un par de tijeras Vannas; </li><li> Coloque el papel de filtro que contiene la retina en un plato de plástico cultura 35 mm con una solución de hialuronidasa y se desprenda la retina del papel de filtro con la ayuda de unas pinzas Dumont # 7; </li><li> Corte de la retina en 4-6 piezas con la mitad de un acero industrial de carbono de un solo filo hoja y dejar que repose en la solución de hialuronidasa durante 20 minutos; </li><li> A la espera de hialuronidasa a surtir efecto, añadir 5 ml de la solución de L-cisteína a la papaína y dejar reposar hasta que el líquido se vuelve transparente (aproximadamente 5-10 minutos); </li><li> Lave las piezas de la retina 3x de bajo Ca 2 + de Ringer y dejar que repose en la solución de papaína durante 30-35 minutos; </li><li> Lave las piezas de la retina 3x de bajo Ca 2 + de Ringer y almacenarlos hasta su uso a 4 ° C en una placa de cultivo de 35 mm de plástico con bajo Ca 2 + de Ringer; </li><li> Para disociar las células, poner un pedazo de retina en un tubo de microcentrífuga que contiene 500 ml de bajo Ca 2 + de timbre y lentamente se tritura la retina con la pipeta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio de disociación, con cuidado de no producir burbujas de aire. Pipetas de disociación se fabrican mediante el calentamiento de la punta de una pipeta Pasteur de vidrio con un mechero de Bunsen y ligeramente curvado, con la ayuda de unas pinzas anatómicas; </li><li> Placa de las células aisladas mediante la adición de una gota de la suspensión de la retina a un casero de grabación de cámara previamente llenada con 2 mL de bajo Ca 2 + de Ringer. La cámara se compone de la mitad inferior de una placa de cultivo de 35 mm de plástico con un conjunto circular en el centro y un cubreobjetos circular de cristal de 1,78 de índice de refracción (PlanOptik, Alemania), pegado a la parte inferior con un elastómero de silicona (Sylgard 184, Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Parte 2: Carga de la célula bipolar y lavar TIRF imágenes de las vesículas sinápticas se realiza mejor con un microscopio TIRFM objetivo de tipo con un objetivo muy alto NA y una cámara sensible. Para nuestros experimentos, hemos optado por utilizar un 1.65 NA objetivo (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japón) con un EMCCD (Cascade 512B, la Ciencia Roper, Tucson, AZ). El uso de la NA objetivo muy alto hace necesario el uso de alta refracción cubreobjetos de vidrio y el líquido de inmersión (di-yodometano con azufre). Bajo nuestras condiciones, la luz de excitación se limita a un campo decae de manera exponencial, con una longitud constante de aproximadamente 50 nm. <ol><li> Añadir una gota de líquido de alto índice de refracción (serie M, el índice de refracción = 1,7800, Laboratorios Cargille, Cedar Grove, Nueva Jersey) con el objetivo del microscopio; </li><li> Coloque la cámara de registro con cuidado en la parte superior del objetivo de microscopio y cuidado montaje de electrodos de tierra y el tubo de salida a la cámara de superfusión; </li><li> Vamos a sentarse en la cámara de microscopio de 10-20 minutos para permitir que las células se hunda y se adhieren a la parte inferior; </li><li> Mientras tanto, preparar 5 ml de una Trolox ® 1mM ((±)- 6-hidroxi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxílico; Sigma, St. Louis, MO) en una solución de alta de K + del timbre . Sonicar hasta que se disuelva; </li><li> Prepare 15 ml de ADVASEP-7 Solución de lavado: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) en el bajo Ca 2 + de Ringer. Tenga en cuenta que ADVASEP-7 uso es opcional y puede omitirse si se desea; </li><li> Purgar la li superfusiónsolución nes y añadir ADVASEP-7 lavado, bajo Ca 2 + del timbre y el control del timbre para el sistema de superfusión; </li><li> Tire de la carga de pipetas de paredes delgadas de vidrio de borosilicato (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Puffer pipeta resistencias se encuentran en el rango de 1.5 a 2.5 mW; </li><li> Preparar el FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutilamino) estirilo) piridinio dibromuro, &quot;un embalaje especial&quot;, Invitrogen, Carlsbad, CA) soluciones. En primer lugar, hacer una acción mediante la adición de 1 mM de 160 l de agua destilada a un vial (100 mg) de FM1-43 ®. Esta población puede mantenerse a 4 ° C durante un máximo de una semana. A continuación, añadir 5 L de FM1-43 ® a 1 ml de alto K + + ® timbre de 1 mM Trolox. Proteja la solución de la luz con papel de aluminio y conservar a 4 ° C hasta su uso; </li><li> A su vez la luz del microscopio de campo claro y buscar para intactas las células bipolares. Ligeramente toque en el microscopio para asegurarse de que las neuronas están firmemente pegados a la parte inferior de la cámara; </li><li> Posición de la pluma de superfusión cerca de la célula de interés y continuamente perfundir la preparación con bajo Ca 2 + de Ringer; </li><li> Apague las luces de la habitación y añadir un filtro de pase largo de color rojo (es decir, RG630, Schott, Alemania) para que el camino óptico para reducir al mínimo la excitación del colorante FM; </li><li> Llenar una pipeta de carga con 10 l de la solución de colorante FM, montaje de la pipeta en el micromanipulador e inferior de la pipeta sobre la preparación, sin exceso de presión hasta que esté en el mismo plano focal como la célula bipolar que desea cargar. Asegúrese de tener al menos dos pinzas de soldadura: la utilizada para el tinte de FM no se puede utilizar para patch clamp, o de lo contrario pueden contaminar la solución intracelular; </li><li> La posición de la apertura de globo a una distancia de unos 10 m de la terminal del axón, a su vez el sistema de superfusión de hojaldre y la solución de colorante durante 10 segundos girando la sobrepresión en la pipeta; </li><li> A su vez el exceso de presión fuera y, sin moverse de la pipeta, espere 30 segundos; </li><li> A su vez la superfusión y se bañan en la cámara en la solución de ADVASEP-7 durante 5 minutos. Al mismo tiempo, eliminar la pipeta de soplado del baño; </li><li> Después de 5 minutos, cambie a la baja de Ca 2 + del timbre y la cámara de perfusión durante 25-30 minutos para permitir la remoción del exceso de tinte. </li></ol> Parte 3: Revisión de sujeción e Imagen TIRFM <ol><li> Mientras que la preparación es lavado, tire pipetas parche de pared gruesa de vidrio de borosilicato (B150-86-10, la compañía de Sutter Instrument, Novato, CA). Parche pipeta resistencias se encuentran en el rango de 8.10 mW; </li><li> Después de lavar se ha completado, coloque el terminal del axón en el centro del campo de visión; </li><li> Llenar una pipeta de parche con 7μL de solución interna, pulse la pipeta para eliminar las burbujas de aire, capa de la pipeta con cera fundida dental (Cera pegajosa, Kerr Corporation, Orange, CA) y montarlo en el micromanipulador; </li><li> A su vez el exceso de presión en la pipeta y baja lentamente la pipeta en la preparación. Compruebe la resistencia de la pipeta en el amplificador y las compensaciones correcta pipeta y capacidad con los controles del amplificador respectivos; </li><li> Cambiar la superfusión para controlar Ringer. Para crear un gigaseal entre la pipeta y la célula, apenas tocar la punta del electrodo contra el cuerpo de la célula y su vez el exceso de presión fuera de la pipeta, mientras que ejerciendo una suave presión negativa al electrodo; </li><li> Mientras sellado, seleccione &quot;célula entera&quot; en el modo de amplificador y ajuste de la célula con un potencial de -60 mV; </li><li> Elija una región de interés con el software de imagen que abarca toda la terminal del axón, a su vez a la luz de campo claro y fuera, con la exposición breve (30 ms) de la terminal con el láser de 488 nm, encontrar el plano focal de la derecha TIRF imágenes; </li><li> Entrar en la célula mediante el &quot;zapping&quot; de comandos del amplificador, mientras que la aplicación de presión ligeramente negativa en la pipeta; </li><li> Correcto para la capacitancia celular y la resistencia en serie, y luego aplicar el protocolo de tensión de interés, mientras que imágenes del movimiento de las vesículas sinápticas. Es en esta etapa tan importante que el protocolo de voltaje sincronizado con la velocidad de fotogramas de la cámara. En nuestro caso, cada cuadro es de 30 ms de largo, por lo que los cambios de tensión se presentan en múltiplos de este valor (es decir, cada 300 ms o marcos 10); </li><li> Espere al menos 40 segundos entre los ensayos para permitir la recuperación; </li><li> Para comprobar la posición de las cintas sinápticas, tomar fotografías mientras se gira el láser de 561 nm en. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1: El montaje del experimento. A 488 nm láser (azul) se centra en la periferia del plano focal posterior del objetivo y sufre una reflexión interna total cuando se llega a la copa-acuosa interfaz de mediano plazo. El campo electromagnético generado por el rayo reflejado excita al fluoróforo carga en las vesículas sinápticas más cercano a la bottom de la cámara de vidrio, que luego fluorescente (verde). La luz fluorescente se guía a los ojos del observador (representados) o una cámara CCD. El potencial de membrana de las células de imágenes se controla de forma simultánea por ellos de patch-clamp. Este enfoque permite el estudio de la relación entre las señales de entrada (el voltaje de la membrana) y la salida neuronal (exocitosis). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2: Los resultados típicos. Izquierda: imagen de campo claro de una célula de peces de colores bipolar aislado. Arriba a la derecha: imagen TIRF de las vesículas sinápticas en el terminal del axón bipolar celular cargado con FM 1-43 ® y la imagen con el láser de 488 nm (FM tinte). Abajo a la derecha: imagen de la misma terminal después de un parche en el celular y la imagen de la terminal del axón con el láser de 561 nm. Cintas sinápticas son etiquetados por la rodamina basado RIBEYE de unión de péptidos (Rpep_rhod). Tabla 1: Reactivos y equipos específicos. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Tipo </td><td> Fabricante </td><td> Catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> - </td><td> Tabla de aire </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscopio invertido </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> Equipado con una lámpara de tungsteno para campo claro y un puerto de apertura lateral para TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Fuente de alimentación de la lámpara </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Filtro dicroico </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Filtro de emisiones </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O HR </td><td> Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red de filtro de vidrio </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm láser </td><td> Coherente </td><td> - </td><td> Utilice la potencia mínima </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Conductor del obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm láser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Conductor del obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Kit de presión de perfusión </td><td> Superfusión sistema </td><td> Automatizar la Ciencia </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusión de la pluma </td><td> Superfusión sistema </td><td> Automatizar la Ciencia </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> Superfusión controlador del sistema </td><td> Automatizar la Ciencia </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascada 512B </td><td> EM cámara CCD </td><td> Roper Científico </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7.1 </td><td> Software de imágenes </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Parche amplificador Clamp </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pulso </td><td> Amplificador de Software </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipulador </td><td> Sutter Instrumento </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Portaelectrodos </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> De 1,5 mm de diámetro exterior de vidrio, 2 unidades </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Capilar de vidrio de borosilicato </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Sin filamento </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Capilar de vidrio de borosilicato </td><td> Sutter Instrumento </td><td> - </td><td> Con filamento </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Microelectrodo Extractor </td><td> Sutter Instrumento </td><td> - </td><td> Equipado con caja de 3x3 y filamento cámara ambiental </td></tr><tr><td> - </td><td> Vacío presión del aire de la bomba </td><td> Thomas Scientific </td><td> 7893B05 </td><td> Crea un vacío para extraer líquidos de la cámara y el exceso de presión para pipetas </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Análisis de Software </td><td> The MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> Placas de 35 mm de Cultura de plástico </td><td> Halcón </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> De vidrio de alta refracción Índice </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Índice de refracción 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Serie M </td><td> Refracción de líquidos de alta Índice </td><td> Cargille Laboratorios </td><td> - </td><td> Índice de refracción = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Kit de elastómero de silicona </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatión </td><td> Tripéptido </td><td> EMD Chemicals </td><td></td><td> Libre radical tesoro </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> Enzima </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Tipo V </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Aminoácido </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Activa la papaína </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Enzima </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> De Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Solubles de vitamina E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Depurador de radicales libres </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sulfonados B-ciclodextrina </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Reduce el FM 1-43 ® fluorescencia de fondo </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Colorante fluorescente </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Embalaje especial&quot; </td></tr><tr><td> Cera pegajosa </td><td> Pipeta agente de recubrimiento </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Disminuye la capacidad de pipeta </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Soluciones fisiológicas utilizadas en este estudio. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> Bajo Ca 2 + de Ringer </td><td> Control del timbre de </td><td> Alto contenido de K + de Ringer </td><td> Solución interna </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatión </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> * CH 3 CsO 3 S </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep Rhod-** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> 200 ml </td><td> 100 ml </td><td> 5 l </td><td> 100 L </td></tr></tbody></table> * Metanosulfonato de cesio. ** RIBEYE de unión a péptido: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol>
	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

Las ventajas de los objetivos de tipo de microscopía TIRF son: 1) que proporciona seccionamiento óptico excelente mediante la restricción de la luz de excitación a una región estrecha en el plano focal del objetivo, minimizando de esta manera fuera del foco de luz, 2) ya que la luz disminuye exponencialmente con la distancia , el movimiento en sentido vertical se puede controlar con un cambio en la intensidad de la fluorescencia, 3) la colección de bajo consumo a través del objetivo de gran apertura numérica de 1,5. <...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Total de reflexión interna de fluorescencia (TIRF) microscopía es una técnica que permite el estudio de los acontecimientos que suceden en la membrana celular, por la imagen selectiva de moléculas fluorescentes que están más cerca de una sustancia alto índice de refracción, como el vidrio<sup&gt; 1</sup&gt;. En este artículo, se aplica esta técnica a la exocitosis la imagen de las vesículas sinápticas en la retina las células bipolares aislados de la retina peces de colores. Estas neuronas son muy adecuados para este tipo de estudios debido a sus grandes terminales de los axones. Al mismo tiempo patch clamp las células bipolares, es posible investigar la relación entre la pre-sináptica de tensión y liberación sináptica<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Las vesículas sinápticas dentro de las terminales de células bipolares se cargan con un tinte fluorescente (FM 1-43 ®) por la co-fumando el tinte y una solución de Ringer que contiene un alto K<sup&gt; +</sup&gt; Concentración en los terminales sinápticos. Esto despolariza las células y estimula la absorción de colorante endocitosis y consecuente en las vesículas glutamatérgicas. Después de lavar el exceso de tinte de distancia de alrededor de 30 minutos, las células están listas para ser sujeta de parches y la imagen al mismo tiempo con un láser de 488 nm. La solución de la pipeta parche contiene un péptido rodamina basado en que se une selectivamente a la cinta RIBEYE proteína sináptica<sup&gt; 4</sup&gt;, Con lo que el etiquetado cintas específicamente cuando los terminales son imágenes con un láser de 561 nm. Esto permite la localización precisa de las zonas activas y la separación de sináptica de extra-sináptica eventos.

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Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

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Research

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Biology

11.6K vistas.  Yale University School of Medicine. En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...