El aislamiento de las células endoteliales e intersticiales de la válvula primaria humana es fundamental para comprender el mecanismo subyacente de la patogénesis de la enfermedad valvular aórtica calcificada. Cuando la válvula se extirpa del tejido nativo, la viabilidad celular disminuye. Así que hemos identificado un método que prolonga la viabilidad celular.
Después de recibir las muestras de tejido valvular extraído, extraer la raíz aórtica y sumergir el tejido en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene solución de enjuague estéril. Después de una incubación de 10 minutos en un cubo de hielo en un balancín, rocíe los tubos con etanol al 70%. En una campana de cultivo de tejido estéril, transfiera el tejido a una placa de Petri y extirpe dos valvas de válvula.
Coloque un folleto en un vial criogénico y congele rápidamente el tejido en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados centígrados. Para fijar el tejido para la tinción del contenido de calcio, corte el segundo folio por la mitad desde el nódulo hasta la bisagra y coloque ambas piezas de tejido en un casete que se sumerge en paraformaldehído al 4%. Luego coloque toda la configuración en el balancín a temperatura ambiente durante un mínimo de dos pero no más de cuatro horas.
Para aislar las células intersticiales de la válvula, transfiera la valva a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros que contenga PBS helado y coloque el tubo en un balancín durante dos minutos a temperatura ambiente. Después de mezclar, transfiera el tejido a un plato de 60 milímetros que contenga de cinco a siete mililitros de solución fría de colagenasa. Use fórceps para sumergir ambos lados de la valva de tres a cuatro veces en la solución antes de incubar el tejido en la incubadora de cultivo celular durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados con un suave balanceo del tejido de tres a cuatro veces cada dos minutos.
Al final de la incubación, transfiera dos mililitros de solución del plato a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Colocando fórceps en el nódulo de la valva, use un hisopo de algodón estéril para deslizar el tejido de las pinzas a la bisagra mientras gira el hisopo a lo largo de la valva. Después de deslizar, enjuague el hisopo en el tubo de solución de colagenasa y frote el otro lado del tejido como se acaba de demostrar.
Después del enjuague, repita el hisopo en ambos lados del tejido y use una pipeta de un mililitro y una solución de colagenasa para enjuagar cualquier célula desalojada de ambos lados de la superficie del folleto en el plato. Después del enjuague, transfiera toda la solución del plato al tubo que contiene las células del hisopo y coloque el tejido de la válvula restante en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros que contenga siete mililitros de solución estéril de colagenasa. Granular las células endoteliales de la válvula aislada por centrifugación y resuspender el pellet celular en tres mililitros de medio de crecimiento celular endotelial vascular.
Después de una segunda centrifugación, resuspenda las células en un mililitro de medio de crecimiento fresco para contar y sembrar las células en una concentración de 5 x 10 a cinco células por centímetro cuadrado en placas de seis pocillos recubiertas de colágeno, enfriando el medio cada tres o cuatro días. Cuando los parches de células endoteliales de la válvula cubren más del 80% de la placa, dividir las células en una concentración de 1,3 x 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado, dependiendo de su tasa de crecimiento. Una vez que las células se han expandido, confirmar su fenotipo de células endoteliales valvulares mediante tinción inmunofluorescente para marcadores de células endoteliales valvulares de interés.
Para aislar las células intersticiales de la válvula, coloque el tubo que contiene el hisopo al tejido de la valva en la incubadora de cultivo celular durante 12 a 18 horas con la tapa ligeramente abierta. Al final de la incubación, use una pipeta serológica para disociar suavemente el tejido para asegurar la liberación de las células intersticiales de la válvula y filtre la suspensión celular a través de un colador de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue siete mililitros de medio de celda intersticial de válvula al tubo y recoja las células por centrifugación.
Resuspender el pellet en un mililitro de medio de crecimiento celular intersticial de válvula fresca para contar y sembrar las células a una concentración de 1.3 x 10 de la cuarta celda por centímetro cuadrado en un plato tratado con cultivo de tejido de 60 milímetros de diámetro. Después de uno o dos días, lave los cultivos dos veces con PBS y agregue medio fresco a las células. Cuando las células alcancen una confluencia del 90%, lave los cultivos dos veces con DPBS y trate las células con dos o tres mililitros de reactivo de disociación precalentado durante dos o tres minutos a 37 grados centígrados.
Cuando las células se hayan desprendido, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico para la centrifugación y resuspenda suavemente el pellet en tres a cuatro mililitros de medio de crecimiento celular intersticial de válvula precalentada para contar. Luego siembra las células en una proporción de uno a dos con respecto a la densidad de cultivo original y evalúa el fenotipo de crecimiento celular intersticial de la válvula mediante tinción inmunofluorescente como se demuestra. Las muestras de tejido de enfermedad valvular aórtica calcificante presentan una morfología alterada con nódulos pesados de calcificación en comparación con las muestras de tejido no calcificado de control.
Cuando la calcificación se evalúa mediante tinción de Von Kossa, se observa precipitación de color marrón oscuro o negro en el tejido del foliolo enfermo. La solución de almacenamiento en frío estabiliza en gran medida las células de tejido valvular extirpadas con una viabilidad de aproximadamente el 40% observada para ambos tipos de células recuperadas hasta 61 horas después de la extracción de la válvula. El análisis morfológico de las células endoteliales de la válvula revela células inhibidas por contacto de crecimiento tipo adoquín empaquetadas, mientras que las células intersticiales de la válvula demuestran una morfología en forma de huso similar a la observada para los miofibroblastos.
La inmunotinción confirma que la mayoría de las células endoteliales y valvulares intersticiales valvulares expandidas expresan los marcadores específicos de tejido esperados. Recuerde que el hisopado suave pero firme de la valva es crítico para la liberación de la capa de células endoteliales, y que la incubación nocturna con colagenasa es necesaria para la liberación de la población de células intersticiales desde el interior del tejido denso. Una vez que se han establecido las líneas celulares, se pueden utilizar para el estudio mecánico de la patogénesis específica de la enfermedad de la válvula aórtica, incluido el inicio de la enfermedad, la progresión y el tratamiento.
