Recientemente, los queratinocitos orales han atraído la atención debido a su propiedad única. Proporcionamos un protocolo para el cultivo de queratinocitos orales de ratón en un estado similar al de las células madre adecuado para aplicaciones posteriores. El cultivo de queratinocitos orales de ratón y características diferentes de queratinocitos cutáneos.
En este protocolo, hemos aislado con éxito el queratinocitos orales primarios de ratón y hemos desarrollado una técnica de cultivo a largo plazo. Este sistema de cultivo se puede emplear en ensayos moleculares y bioquímicos para comprender mejor la característica de las células madre basilares orales y sus enfermedades relacionadas. Después de sacrificar un ratón adulto C57BLK6J, retire el vello alrededor de la boca con una afeitadora y usando tijeras, corte desde las mejillas hacia la mandíbula en ambos lados.
A continuación, use fórceps para abrir la boca de par en par y absorber la sangre con un hisopo de algodón, luego desinfecte la paleta limpiando el interior de la boca con un hisopo de algodón que contenga 10% de povidona yodada. Para cosechar la paleta del ratón, primero usando una cuchilla de bisturí quirúrgica, haga una incisión marginal de espesor completo a lo largo del lado de la paleta de los dientes maxilares. Luego, usando un raspatorium, diseccione cuidadosamente toda la paleta.
Transfiera rápidamente el tejido de la paleta a un tubo de 15 mililitros que contiene cuatro mililitros de medio completo suplementado con antibióticos y antimicóticos. Mantenga los tejidos en hielo hasta que estén listos para la incubación. En una campana de flujo laminar, transfiera los tejidos a un plato de 60 milímetros que contenga cuatro mililitros de medio completo con antibióticos y antimicóticos.
Luego, usando fórceps cortos y contundentes y una cuchilla de bisturí, retire suavemente la sangre de los tejidos y lave los tejidos 10 veces con el medio completo. Después del último lavado, transfiera los tejidos a un plato de 35 milímetros que contenga cuatro mililitros de tripsina al 0,025% suplementado con antibióticos y antimicóticos. Coloque los tejidos con la superficie epitelial hacia abajo e incube durante 16 horas a temperatura ambiente en la campana de cultivo.
Después de la digestión de tripsina durante la noche, use un par de fórceps contundentes para eliminar el tejido de la solución de tripsina y transfiéralo a un plato de 60 milímetros que contenga una solución inhibidora de tripsina con la superficie epitelial hacia arriba. A continuación, sosteniendo el borde de la paleta con fórceps, use la hoja del bisturí para raspar suavemente la capa epitelial de la lámina propia subyacente. Para recolectar la cantidad máxima de células epiteliales de los tejidos, transfiera el tejido a otro plato de 60 milímetros con cuatro mililitros de medio completo y repita el raspado como se demostró anteriormente.
A continuación, coloque un colador de células estéril de 100 micras encima de un tubo cónico de 50 mililitros. Y usando una pipeta estéril, transfiera dos mililitros de solución de tripsina al colador para humedecer su superficie. Luego, usando una pipeta, mezcle la suspensión celular en el plato de 60 milímetros varias veces y filtre las células a través del colador de células de 100 micras.
Para contar el número de células, agregue 15 microlitros de la suspensión celular a 50 microlitros de solución azul de tripano, luego transfiera 10 microlitros de la mezcla de azul de tripano celular a un hemocitómetro y cuente el número de células. A continuación, centrifugue la suspensión celular, retire el sobrenadante y agregue dos mililitros de medio completo que contenga Chelex FBS al tubo. Resuspend el pellet celular titulando varias veces usando una pipeta de cinco mililitros.
Luego, coloque de dos a cinco veces de 10 a la quinta célula de un ratón en un pozo de placa de 24 pocillos precubierta con colágeno tipo uno e incube las células a 37 grados Celsius durante dos días sin cambiar el medio. Los queratinocitos orales primarios crecieron como una monocapa y mostraron una morfología de adoquines. Pequeñas colonias de queratinocitos fueron visibles después de tres y cinco días.
Después de una semana de incubación, estas colonias crecieron y formaron colonias apretadas. El primer pasaje se realizó dos semanas después del recubrimiento inicial y en pasajes posteriores, los queratinocitos exhibieron un crecimiento estable con un período de cultivo más corto. Los queratinocitos dejaron de crecer si se produjo una contaminación significativa de fibroblastos durante el proceso de aislamiento.
Después del cultivo, los queratinocitos expresaron queratina 14 y alfa6-integrina. Las células de paso temprano y tardío mostraron una expresión uniforme de P63 confirmando su tallo. Sin embargo, los queratinocitos tratados con alto contenido de calcio exhibieron una disminución de la expresión de P63, lo que indica que el tratamiento con alto contenido de calcio suprime los genes relacionados con las células madre.
El marcador de diferenciación queratina 13 mostró una expresión rara o nula en pasajes tempranos y tardíos, pero una expresión significativa en el tratamiento con alto contenido de calcio. El marcador de fibroblastos PDGFR alfa no se expresó en el cultivo de queratinocitos, lo que indica que este protocolo podría aislar con éxito los queratinocitos basales y mantener estas células en el estado indiferenciado. La captura debe comenzar desde el lado epidural y 10 minutos por muestra de tejido.
También en general, el pipeteo de las células es importante para una mejor viabilidad celular. Después de dos o tres pasadas, el queratinocitos orales se vuelve estable para experimentos funcionales adicionales. Es importante destacar que este protocolo se puede combinar con la vida de ratones transgénicos para ensayos celulares y moleculares in vitro.
Estudios recientes han reportado la dinámica y heterogeneidad de las células madre basilares orales. Este método facilitará el estudio de la biología de las células madre orales y conduce a una mejor comprensión de las enfermedades orales.
