El uso de células aisladas de la válvula del ratón es esencial investigar el camino de la señalización que lleva a la calcificación de la válvula en el uso de células modificadas genético de ratones transgénicos. La digestión en dos pasos es un método rápido y eficiente. La parte más desafiante de este protocolo es el aislamiento de la válvula aórtica a partir de ratones de ocho semanas.
Es mejor practicar en ratones mayores para visualizar mejor la válvula aórtica. Antes de comenzar el experimento, limpie y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y el espacio de trabajo con etanol al 70% y autoclave los instrumentos quirúrgicos durante 30 minutos. Cuando la configuración inicial esté lista, comience con la limpieza del pecho y la región del abdomen de un ratón eutanásico de ocho semanas de edad con etanol.
Usando tijeras, abra el abdomen y el pecho del ratón, luego corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo con pequeñas tijeras quirúrgicas. Retire la sangre del corazón perfundiendo 10 mililitros de PBS frío y corte el corazón, manteniendo tres milímetros de la aorta ascendente. Debajo de un estereomicroscopio, diseccione la válvula aórtica cortando el corazón horizontalmente en el medio de los ventrículos y cortando el ventrículo izquierdo hacia la aorta, luego diseccione cuidadosamente la válvula aórtica.
Aglutica las válvulas en un pequeño plato de cultivo de tejidos de 35 milímetros. Lave las válvulas aisladas en un plato de cultivo celular de 75 mililitros con cinco mililitros de HEPES frío de 10 milimolares recién preparados suplementado con antibióticos e incube en cinco mililitros de colagenasa tipo uno durante 30 minutos a 37 grados Centígrados con agitación continua. Después de la incubación, centrifugar el tubo durante cinco minutos, a 150 veces G y lavar el pellet una vez con dos mililitros de 10 milimolares HEPES con vórtice a alta velocidad durante 30 segundos.
Recoja la suspensión resultante del tubo en un plato de cultivo de 35 milímetros y use pinzas delgadas para transferir cuidadosamente los fragmentos de tejido a un tubo fresco. Luego incubar el pellet en un tubo de 15 mililitros con cinco mililitros de colagenasa tipo uno a 37 grados Centígrados bajo agitación continua durante 35 minutos. Separe las células reutilizando con una pipeta de un mililitro y centrífuga a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Limpie las células dos veces reutilizando el pellet separado en dos mililitros de DMEM completo y centrifugando a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados. Para el revestimiento, resuspend el pellet en un mililitro de medio completo y añadirlo a un pozo de un plato de cultivo celular de seis pozos en una cantidad mínima de medio. Mantenga las placas sin ser molestadas a 37 grados Centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Después de tres días de incubación, confirme el crecimiento cerca de los restos de tejido observando las células bajo el microscopio. Una vez que 1, 000 células son visibles, retire cuidadosamente los restos de tejido con pinzas en autoclave y cambie el medio. Tripsinizar las células después de alcanzar el 70% de confluencia y transferirlas a un plato de cultivo de tejido de 75 mililitros.
Antes de comenzar el ensayo, limpie la campana de bioseguridad con etanol al 70% y caliente el medio DMEM a 37 grados Centígrados. A continuación, sembrar 100, 000 células por condición en seis placas de pozo en DMEM completo y cultivo a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, reemplace el medio sobrenadante con el medio calcificante e incube las células durante siete días a 37 grados Celsius, reemplazando el medio en el tercer día.
Después de siete días, mida la concentración de calcio en una placa de 96 pozos utilizando el reactivo Arsenazo III y registrando la absorbancia a 650 nanómetros. En el análisis representativo, varios fenotipos de la célula de la válvula fueron identificados con la coloración inmunofluorescente después de tres a cinco días de cultura. Ratón VIC de vimentina expresada y alfa SMA, los marcadores significativos de las células valvulares.
Además, la coloración inmunofluorescente CD31 no verificó ninguna contaminación de las células endoteliales en cultura de VIC. El cultivo de VIC con medio calcificante rico en fosfato estimula una calcificación en las células, confirmada aún más con la tinción positiva roja para los ganglios de calcio. El protocolo se basa en un pool de tres a cinco válvulas de diferentes ratones.
El uso de pareja de camada y tres réplicas biológicas diferentes es importante para validar los hallazgos. El uso de células de válvula de ratón es vital para comprender la vía molecular que conduce a la estenosis aórtica mediante el aislamiento de células de ratones transgénicos. Este protocolo se ha utilizado previamente para investigar la implicación del camino al receptor en la regresión mineral de la válvula aórtica calcificada.
