El objetivo general de este procedimiento es observar la ultraestructura de los megacariocitos ubicados dentro de la médula ósea del ratón y cuantificar las diferentes etapas de maduración utilizando microscopía electrónica de transmisión de alta resolución. La principal ventaja es el examen directo de los megacariocitos en el medio nativo, que difiere de los megacariocitos cultivados in vitro que como sabemos no alcanzan el nivel completo de maduración. Después de cosechar la tibia y los fémures de ratones C57BL / 6 de 12 a 18 semanas de edad de acuerdo con los protocolos estándar, use una cuchilla de afeitar afilada para eliminar las epífisis de cada hueso.
Sosteniendo cada hueso con pinzas, inserte una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de cinco mililitros llena de tampón de cacodilato en un extremo del hueso y enjuague la médula ósea en un tubo de recolección de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tampón de cacodilato fresco. Inmediatamente después del lavado, use una pipeta de plástico para transferir los cilindros de médula ósea en un mililitro de solución fijadora de glutaraldehído fresco para una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente. Para incrustar la médula ósea en agarosa, lave las muestras fijas en tampón de cacodilato fresco y use una pipeta de plástico para transferir cuidadosamente la médula ósea a un portaobjetos de vidrio.
Usando una pipeta tibia, aplique rápidamente una gota de agar líquido al 2% a los cilindros de médula ósea e inmediatamente coloque el portaobjetos sobre hielo durante uno o dos minutos. Cuando el agar se haya solidificado, use un microscopio estereoscópico y una cuchilla de afeitar afilada para descartar las extremidades de cada cilindro de médula ósea y transferir los bloques de médula recortados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de tampón de cacodilato. Para la incrustación de resina, fije los bloques con tetróxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato en una campana química durante una hora a cuatro grados centígrados antes de lavar los bloques una vez con tampón de cacodilato y una vez con agua destilada.
Después del lavado con agua, manche los bloques con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante una hora, seguido de dos lavados en agua destilada como se ha demostrado. Después del último lavado, deshidratar los bloques a través de una serie ascendente de inmersiones de etanol y agua destilada según lo indicado. Para obtener una infiltración y polimerización uniformes de la resina epoxi dentro de la médula, incube los bloques en dos baños sucesivos de óxido de propileno durante 15 minutos antes de incubar las muestras en una mezcla uno a uno de óxido 100% propileno y resina epoxi durante una hora en un agitador rotativo lento a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, agregue resina epoxi 100% a los bloques de médula para una incubación nocturna en las mismas condiciones, luego agregue resina epoxi 100% durante otra incubación de dos horas. Al final de la incubación, use un microscopio para orientar los bloques de médula en moldes planos de silicona para permitir su posterior sección transversal y llene los moldes con resina epoxi antes de colocarlos a 60 grados centígrados durante 48 horas. Para una sección ultrafina, monte el bloque de muestra en un soporte de ultra microtomo y monte el soporte en el soporte de muestra.
Use un cortador de fresado de diamante para recortar las muestras en un ángulo de 45 grados para eliminar el exceso de resina alrededor del tejido antes de usar una hoja de cuchillo de diamante equipada con un tanque de agua para cortar secciones transversales de 500 y 100 nanómetros de espesor para el análisis histológico y TEM respectivamente, luego use un bucle para transferir las secciones de 500 nanómetros de espesor que flotan en la superficie del agua en un portaobjetos de vidrio y depositar el espesor de 100 nanómetros secciones en rejillas de cobre de 200 barras delgadas de malla con un filtro de papel debajo. Para la tinción de azul toluidina, después de dibujar las secciones de 500 nanómetros de espesor en una placa caliente de 60 grados, agregue azul de toluidina filtrado al 1% en agua destilada a las secciones para una incubación de uno a dos minutos. Al final de la incubación, lave las muestras con agua destilada.
Cuando las diapositivas se hayan secado, utilice el medio de montaje para montar las muestras con un cubrebosques y ver las muestras mediante microscopía de luz. Para la tinción de contraste, etiquete las secciones de 100 nanómetros con acetato de uranilo al 4% durante cinco minutos, seguido de tres lavados de cinco minutos con agua destilada. Después del último lavado, manche las secciones con citrato de plomo durante tres minutos, seguido de tres lavados de cinco minutos en agua destilada como se ha demostrado.
Después del último lavado, coloque primero el lado inferior de cada rejilla en contacto con un trozo de papel de filtro para permitir que las rejillas se coloquen sobre el papel de filtro para que se sequen. Para examinar las secciones por TEM, cuando las rejillas se hayan secado, seleccione un aumento bajo para evaluar la calidad general de las preparaciones. Para determinar el número de megacariocitos de cada etapa de maduración en cada sección transversal, seleccione un aumento más alto y cuantifique el número de megacariocitos de etapa I, II o III solo en cuadrados que estén completamente cubiertos por tejido.
En este análisis histológico representativo, se puede observar claramente la continuidad de los microagósticos de compacidad y el tamaño y la forma de los megacariocitos. Los megacariocitos murinos se dividen en cuatro etapas de maduración. Los megacariocitos en estadio I tienen un núcleo grande.
La presencia de la etapa detectable más temprana del sistema de membrana de demarcación es también un criterio clave de esta etapa. En la etapa II, comienza la formación de gránulos y se inicia el desarrollo del sistema de membrana de demarcación. Los megacariocitos en estadio III son células gigantes con sistemas de membrana de demarcación bien desarrollados, territorios citoplasmáticos claramente definidos y zonas periféricas desprovistas de orgánulos y núcleos localizados excéntricamente.
La etapa de pirenocitos de maduración de megacariocitos se caracteriza por un núcleo desnudo. Como se ilustra, los megacariocitos se observan con frecuencia en contacto con las células endoteliales. En ocasiones, los megacariocitos forman protuberancias invasivas cortas que penetran en el endotelio o extienden los proplatlets hacia la luz sinusoidal.
TEM también permite la visualización de detalles ultra estructurales, así como la presencia de células hematopoyéticas que han sido engullidas por los megacariocitos. El enrojecimiento de la médula ósea debe realizarse con cuidado e inmediatamente después de la disección ósea. Para maximizar la integridad del tejido, la médula se rodea con un gel de agar antes de la deshidratación.
Después de este procedimiento, los bloques de médula ósea se pueden obtener imágenes a diferentes aumentos o se pueden usar para otros análisis de microscopía electrónica 3D, como la microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocado.
