Damos las gracias a Adam Coster y todos los demás miembros de los laboratorios Altschuler y Wu para la retroalimentación útil y discusiones. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones R01 GM085442 y CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) y la Fundación Welch I-1619 (SJA) y I-1644 (LFW).

1. Muestras Preparación y Imaging <ol><li> Cultivo celular <ol><li> Dividir culturas rutinaria y mantener al 20-70% de confluencia. Un día antes del experimento, crecer células HeLa en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco, véase la Tabla de Materiales) y suplementado con 10% de FBS (suero bovino fetal) y 1x penicilina / estreptomicina. </li><li> En el día de experimento, las células de división cada vez mayor en la cultura (alrededor del 50% de confluencia). </li><li> Lavar las células con PBS (tampón fosfato salino), exponerlo a aproximadamente 2 ml de tripsina / EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) durante unos segundos. Aspirar el exceso de tripsina / EDTA y mantener las células bañadas en una fina película de tripsina / EDTA en la campana a temperatura ambiente durante ~ 3 min. </li><li> Mecánicamente matraces de agitación dos veces y separar las células con medio de suero suplementado. Contar las células y se diluye hasta 5000 células/50 l de los medios de comunicación y la placa de inmediato 50 l / pocillo en una placa de fondo de cristal de 384 pocillos usando un robot de manejo de líquidos automatizado (sólo 30, asís de la placa se utilizan aquí). </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 min para minimizar los efectos de borde en pozos 5. Después de la incubación RT, coloque las placas de un ° C / 5% de CO 2 incubadora a 37 durante la noche. </li><li> Cada fármaco se ensayó por duplicado. Añadir 25 l de fármaco a los pocillos correspondientes en la placa ya que contiene los medios de comunicación. </li><li> Fijar la placa con una solución de paraformaldehído al 4% en PBS a 24 h después de tratamiento contra las drogas. </li></ol></li><li> La tinción Los anticuerpos específicos primaria, secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia, y otras manchas fluorescentes que fueron utilizados aquí se listan en la Tabla de Materiales. <ol><li> Permeabilizar fijo células con 0,2% Triton X-100 solución en TBS (Tris-buffer salina) durante 3 minutos, y lavar con TBST (Tris-buffer salino + Tween 20) 3x. Añadir BSA (albúmina de suero bovino) solución al 5% en TBST para el bloqueo. </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 horas y después lavar con TBST 3x. </li><li> Hacer DILUT anticuerpo primarioiones en 5% de BSA en TBST (véase la Tabla de Materiales) y añadir 10 l / pocillo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h, y luego se lava 3 veces con TBST. </li><li> Hacer dilutionin anticuerpo secundario 5% de BSA en TBST (véase la Tabla de Materiales) y añadir 10 l / pocillo. </li><li> Incubar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 horas y después se lava dos veces con TBST. </li><li> Preparar diluciones para Hoechst y phalloidin (véase la Tabla de Materiales) en PBS y añadir 10 l / pocillo. </li><li> Incubar la placa en la oscuridad durante 30 min a TA. </li><li> Después de 2 lavados TBST, placas de cubierta en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imaging Adquirir imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia utilizando un objetivo de 20X con cámara 1x1 hurgar en la basura. Adquirir dieciséis imágenes para cada pozo, para un total de 480 imágenes (canales x3). </li></ol> 2. Análisis de Imágenes Descargue e instale PhenoRipper de phenoripper.org, y lanzar PhenoRipper para comenzar el análisis de imaGes. PhenoRipper actualmente soporta TIFF, PNG y JPEG y el resto de los formatos soportados por MATLAB (software microscopio normalmente ayudas a la exportación a TIFF). 2.1 Carga de Datos <ol><li> No existe una convención de nombres / organización estándar para imágenes de microscopía, que pueden hacer la carga de imágenes y metadatos asociar (es decir anotación experimental como el tipo de tratamiento, así el número y así sucesivamente), la parte más difícil del flujo de trabajo. Elija uno de los métodos presentados (que se describe más adelante). <ol><li> PhenoLoader: Elija esta opción para semiautomática cargar datos cuando el nombre de archivo y / o estructura de directorio contienen información suficiente para agrupar imágenes como desee (por ejemplo, B16 HeLa_Drug5-DAPI.png podría indicar que la imagen es del bien B16, las células se tratan con el fármaco cuyo identificador es 5, y la imagen captura la mancha DAPI nuclear - con esta convención de nomenclatura, todas las imágenes de pocillo A1 o tratados con drogas 5 podrían agruparse fácilmente). El asistenteguiar al usuario paso a paso para asociar los metadatos con grupos de imágenes y definir los marcadores de la siguiente manera: <ol><li> Haga clic en &quot;Estructura de archivos&quot; para acceder a la ventana PhenoLoader. </li><li> Haga clic en &quot;Definir Directorio raíz&quot; para seleccionar el directorio que contiene el conjunto de datos de imágenes. Luego filtrar los archivos que no se usan (los archivos no utilizados) para el análisis (opcional, se puede dejar vacío). </li><li> Haga clic en &quot;Definir marcadores&quot; para especificar los biomarcadores utilizados en el experimento y asociarlos con las imágenes. En concreto, haga clic en un archivo de imagen y seleccione una parte del nombre de archivo que identifica de manera única los biomarcadores. Por último, introduzca un nombre para cada biomarcador. </li><li> Haga clic en &quot;Definir Metadatos&quot; para asociar la información con cada imagen. En concreto, haga clic en un archivo de imagen y, a continuación, seleccione una parte del nombre del archivo la información de identificación de imagen (por ejemplo, &quot;B16&quot; para el nombre también). Una ventana solicitando un nombre de grupo (por ejemplo, &quot;Nosotrosll &quot;) se abrirá, escriba un nombre. Los miembros del grupo extraído del nombre del archivo se mostrará en la tabla del grupo (por ejemplo, la lista completa de los nombres también). Para agregar información adicional que no se presente en el nombre del archivo, haga clic en el&quot; (opcional) Siguiente &quot;. Haga clic en&quot; Agregar metadatos de grupo &quot;, introduzca el nombre del grupo adicional (por ejemplo,&quot; Medicamentos &quot;) y para cada valor del grupo predefinido (por ejemplo,&quot; Bueno &quot;), introduzca su valor (por ejemplo,&quot; taxol &quot;) . No hay límite para el número de grupos adicionales que se pueden agregar. </li><li> Por último, haga clic en &quot;Crear MetaDataFile&quot; para generar el archivo de metadatos y continuar con el análisis. Si un archivo de metadatos se ha generado con anterioridad, los pasos anteriores se pueden evitar mediante la carga directamente el archivo utilizando la opción &quot;Metadatos Archivo&quot; (descrito en 3 abajo). </li></ol></li><li> Plantillas de expresiones regulares Basada: Las expresiones regulares son un método estándar para hacer coincidir los patronesen el texto. Elija esta opción cuando el nombre de archivo y / o estructura de directorio contienen información suficiente para agrupar imágenes y la convención de nombres coincide con una de las plantillas pre-existentes. Las plantillas personalizadas basadas en expresiones regulares también se pueden definir y reutilizar de forma manual. Esta opción avanzada sólo se recomienda para usuarios familiarizados con las expresiones regulares. </li><li> Metadatos Archivo: Elija esta opción para personalización final. Definir y cargar un archivo de valores separados por comas (CSV) que contiene los nombres de archivo y los metadatos asociados a cada imagen. Un ejemplo del formato de archivo está disponible en la parte de descarga del sitio web (phenoripper.org). Sólo tiene que cargar el archivo a través de la interfaz para mostrar la información que contiene. </li></ol></li><li> Seleccione el campo de metadatos que definen las repeticiones en el experimento para evitar el muestreo redundante. Para los conjuntos de datos que contienen repeticiones (por ejemplo, todas las imágenes en un pozo deben ser similares), que las agrupa (por ejemplo, también) puede imprrendimiento ove. En la mayoría de los casos es razonable elegir la opción predeterminada &quot;Random (no sé)&quot;, que selecciona un subconjunto aleatorio. </li></ol> 2.2 Establecer parámetros de análisis Haga clic en &quot;Ajustar parámetros&quot; para definir los parámetros necesarios para procesar el conjunto de datos. Los parámetros a definir son en el panel de la izquierda. El panel derecho muestra una muestra de la fusión del conjunto de datos. Haga clic en las flechas izquierda / derecha para cambiar entre las diferentes imágenes. <ol><li> Intensidad Umbral: Elija un valor umbral adecuado para identificar más o menos las porciones celulares (en lugar de los antecedentes, las regiones no celulares) de imágenes. Un umbral se calculan previamente por PhenoRipper, pero se puede ajustar para mejorar el resaltado de las regiones celulares usando la barra de desplazamiento disponibles en la parte superior de la imagen. Si un umbral elegido no funciona a través de todas las imágenes, reducir el umbral a fin de incluir regiones no celular en lugar de dejar caer regiones celulares. </li><li> Bloque Size: Elija un tamaño de bloque apropiado (en píxeles) de la rejilla de la imagen. Los bloques de tamaño especificado se superponen a la imagen. Ajustar el tamaño de bloque para obtener un promedio de 20 a 30 bloques / célula. Para superponer la cuadrícula sobre la imagen, haga clic sobre la casilla de verificación situada delante del campo &quot;Tamaño de bloque&quot;. </li><li> Parámetros opcionales: Si las imágenes en escala de automóviles no se muestran los marcadores con intensidades relativas deseadas (por ejemplo, un color es saturada) o si los marcadores necesitan ser eliminado del análisis, utilice la opción &quot;Ajuste de Intensidad de canales&quot;. Para identificar las regiones celulares en un subconjunto de los marcadores utilizar los &quot;canales utilizados para Umbral&quot; opción. Opciones por defecto de los demás parámetros son generalmente adecuados, pero si es necesario, ajustar usando el menú &quot;Opciones avanzadas de análisis&quot;. </li><li> Ejecute el análisis pulsando &quot;PhenoRip&quot; en el panel principal de la aplicación. PhenoRipper identificará automáticamente los tipos de bloques recurrentes en las imágenes. Perfiles fenotípicos serán generados porcada imagen basado en las fracciones de los diferentes tipos de bloques en el mismo. </li></ol> 3. Exploración de Resultados <ol><li> Explora las relaciones entre los perfiles fenotípicos de las imágenes utilizando el PhenoBrowser (Figura 1). La interfaz PhenoBrowser consiste en cuatro paneles: el panel superior izquierdo es una representación gráfica (gráfico de dispersión) de la relativa similitud entre las diferentes imágenes / condiciones, los dos paneles en las imágenes de muestra pantalla derecha de enfermedades específicas, y el panel final (gráfico de barras ) compara sus perfiles fenotípicos. </li><li> &quot;Descartar Marcos Vacíos&quot; utilizando el menú &quot;Procesamiento de datos&quot;. </li><li> Eliminar imágenes de mala calidad: En primer lugar, estudiar las imágenes individuales desactivar el agrupamiento en el menú &quot;Procesamiento de datos&quot;. A continuación, haga clic a través de los puntos atípicos en el gráfico de dispersión y deseche las imágenes de baja calidad (por ejemplo, fuera de foco, artefacto tinción). </li><li> Explora los datos: Decidir los metadatos que define el terrenouna unidad básica de comparación (por ejemplo, para comparar las drogas, las imágenes con el mismo valor del campo de metadatos &quot;drogas&quot; deben ser agrupados juntos). Contraer todas las imágenes con el mismo valor de este campo de metadatos en un solo punto de datos con &quot;Agrupar por&quot;. Por ejemplo, la agrupación por la droga tendrá un promedio de las imágenes dentro de cada medicamento para producir un punto por drogas. Puntos cercanos (o lejanos) en el gráfico de dispersión reflejan las condiciones que provocan fenotipos celulares similares (o diferentes). Puntos de colores o etiquetas (menú de visualización de datos) basado en metadatos disponibles para ayudar interpretabilidad. La parcela en 3D se puede girar haciendo clic en la casilla de verificación &quot;rotativo&quot; y haciendo clic en el botón izquierdo y arrastrando el ratón sobre él. </li><li> Seleccione dos puntos diferentes para compararlos directamente. Los paneles de imágenes se mostrarán imágenes de muestra para cada punto, y el panel gráfico de barras mostrará los tipos de bloques cuyas frecuencias ocurrencia son más diferentes entre los dos puntos. </li><li> Inicie la clustergram en el menú &quot;Clustergram&quot; para ofrecer una visión más global de la relación entre los tipos de bloques y las condiciones experimentales. Al agrupar los dos tipos y condiciones de bloques, esta representación se destacan los fenotipos celulares que mejor distinguen a grupos de condiciones (Figura 5). </li></ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El flujo de trabajo aquí descrito permite la caracterización y comparación de imágenes de microscopía fácil y rápido. En primer lugar, demostramos cómo este flujo de trabajo puede ayudar a la optimización de experimento, por ejemplo mediante la realización de controles de calidad de forma rápida en las imágenes de microscopía. A continuación, se demostró su potencial para el análisis de los datos de detección de alto rendimiento: hemos sido capaces de drogas del grupo en función de su mecanismo de acci...

Durante la última década, los rápidos avances en la tecnología de imágenes han dado muchos laboratorios la capacidad de realizar la microscopía de alto rendimiento. Ahora, el reto se ha desplazado de una de las imágenes a una de análisis. ¿Cómo podemos caracterizar, comparar y explorar el torrente de complejos fenotipos aún sutiles generadas por una típica pantalla de proyección de imagen de alto rendimiento? Una serie de análisis de imagen e informática plataformas han dado los usuarios cajas de herramientas sofisticadas 1-3 para la extracción de información biológica de las grandes colecciones de imágenes. Sin embargo, muchos obstáculos persisten importantes en el análisis de los datos de las pantallas basadas en imágenes de alto rendimiento. Las dificultades involucradas con la elección de las caracterizaciones adecuadas de las imágenes y el ajuste fino de los parámetros algorítmicos (para el sistema de interés) a menudo resultan en largos tiempos de preparación, especialmente para los usuarios sin conocimientos de análisis de imagen. En particular, la segmentación de células, el proceso de identificación de células individuales en unimagen n, es un cuello de botella importante en este sentido. La segmentación puede ser altamente sensible a los parámetros experimentales tales como el tipo de células, la densidad celular y bio-marcadores, y con frecuencia requiere ajuste repite para un gran conjunto de datos. Por estas razones, el análisis de imágenes es a menudo un paso independiente, el terminal realizada por especialistas en lugar de una parte integrada del flujo de trabajo experimental. Esto excluye el ciclo de retroalimentación rápida entre el análisis y la experimentación, una parte crucial del desarrollo del ensayo. Aquí se describe un flujo de trabajo alternativo que está optimizado para microscopía de fluorescencia de alto rendimiento y evita muchos de los problemas antes mencionados. Para ello, hacemos uso de PhenoRipper 4, una plataforma de software de código abierto para la exploración y el análisis de imágenes de microscopía rápido. Significativamente, PhenoRipper evita muchos de los desafíos que implica la segmentación celular por no tratar de identificar células individuales. En lugar de ello, PhenoRipper divide las imágenes en píxelesbloques de tamaño subcelular y caracteriza las imágenes en función de los bloques que contienen. Específicamente, PhenoRipper Perfiles de bloques, en términos de funciones de marcador que-a base de colocalización y automáticamente identifica 4 los tipos de bloques más representativos de las imágenes de entrenamiento. PhenoRipper continuación, asigna a cada bloque del tipo de bloque representante más similar, y, finalmente, caracteriza a las imágenes basadas en los tipos de los bloques que contienen. En comparación con los métodos más tradicionales sencillos basados ​​en células, este enfoque requiere sintonía fina mínima y experiencia. Como tal, los usuarios sólo tienen que configurar dos parámetros: el tamaño de bloque y una intensidad umbral (para descartar porciones no celulares de una imagen), ambos de los cuales se establece con información gráfica. Es importante destacar que el flujo de trabajo descrito aquí se ha mostrado 4 de escalar fácilmente a conjuntos de datos mucho más grandes, donde la velocidad y la puesta a punto mínima proporciona gran tiempo y las ganancias de fiabilidad. En la práctica, nos encontramos con que esta aplicacióncucaracha reduce el tiempo necesario tanto para la instalación y funcionamiento de múltiples órdenes de magnitud 4. La salida primaria de PhenoRipper es una representación visual de la imagen de similitud, que permite al usuario para identificar grupos de condiciones experimentales que causan que las células muestran fenotipos similares. Las agrupaciones PhenoRipper encuentra típicamente tienen &quot;interpretabilidad biológica&quot; comparables a los generados por, métodos basados ​​en células que consumen más tiempo 4. En la práctica, esto significa que, a menudo, en menos de media hora de la realización de una típica de 96 pocillos experimento microscopía de fluorescencia, un experimentador sin experiencia de análisis de imagen previa se puede obtener una lectura fiable sobre el rendimiento de su experimento. El experimentador puede entonces comenzar a explorar las relaciones entre las diferentes condiciones experimentales y relacionar estas relaciones con los fenotipos de imagen. Demostramos este flujo de trabajo aquí mediante el análisis de los efectosde medicamentos en clases mecanicistas distintos sobre células HeLa teñidas para marcadores de ADN y del citoesqueleto. Imágenes de las células tratadas con la misma clase de fármacos se agruparon, y las imágenes de mala calidad (artefactos de tinción, de las células de enfoque y así sucesivamente) aparecieron como los valores extremos, haciendo que sean fáciles de identificar y potencialmente descartar. Mientras que este flujo de trabajo es útil para un gran número de ensayos basados ​​en imágenes, está claro que hay muchas situaciones en las que un enfoque diferente podría ser potencialmente más informativo. Por ejemplo, la salida de PhenoRipper es principalmente una comparación relativa de patrones de fluorescencia a través de condiciones experimentales. Si se requiere una caracterización absoluta de un rasgo de células única específica en lugar (por ejemplo, el número de motas en una célula), se requeriría un análisis único-basado en células. Sin embargo, incluso en este tipo de situación, es probable PhenoRipper para detectar cambios en estos fenotipos de una sola célula y por lo tanto ser una herramienta útil para el ensayo de Optimización.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

A pesar de los rápidos avances en microscopía de alto rendimiento, los ensayos basados ​​en imágenes cuantitativos siguen planteando retos importantes. Aunque una variedad de herramientas especializadas de análisis de imagen están disponibles, la mayoría de los flujos de trabajo basados ​​en análisis de imágenes tradicionales tienen empinadas curvas de aprendizaje (para el ajuste fino de los parámetros de análisis) y dan lugar a tiempos de respuesta largos entre las imágenes y el análisis. En particular, la segmentación de células, el proceso de identificación de células individuales de una imagen, es un cuello de botella importante en este sentido. Aquí presentamos un suplente,-segmentación libre de células de flujo de trabajo basado en PhenoRipper, una plataforma de software de código abierto diseñado para el rápido análisis y exploración de imágenes de microscopía. El oleoducto que aquí se presenta está optimizado para imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de cultivos celulares y requiere mínima intervención del usuario. Al cabo de media hora, PhenoRipper puede analizar los datos de un experimento típico de 96 pocillos y generar perfiles de imagen. Los usuarios puedenluego explorar visualmente sus datos, lleve a cabo el control de calidad en su experimento, garantizar una respuesta a las perturbaciones y comprobar la reproducibilidad de repeticiones. Esto facilita un ciclo de retroalimentación rápida entre el análisis y la experimentación, que es crucial durante la optimización de ensayo. Este protocolo es útil no sólo como un análisis de primer paso para el control de la calidad, pero también puede ser utilizado como una solución de extremo a extremo, especialmente para el cribado. El flujo de trabajo descrito aquí se escala para grandes conjuntos de datos, tales como los generados por las pantallas de alto rendimiento, y se ha demostrado al grupo de condiciones experimentales por fenotipo con precisión en una amplia gama de sistemas biológicos. La interfaz PhenoBrowser proporciona un marco intuitiva de explorar el espacio fenotípico y relacionar propiedades de imagen en las anotaciones biológicas. En conjunto, el protocolo descrito aquí bajará las barreras para la adopción de un análisis cuantitativo de las pantallas de imagen basados.

Aquí hemos probado la capacidad de este flujo de trabajo para los medicamentos del grupo en función de su mecanismo de acción. Células HeLa fueron sembradas en 30 pocillos de una placa de 384 pocillos y se tiñeron para ADN / actina / α-tubulina. Los anticuerpos específicos primarios, anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, y otras manchas fluorescentes que fueron utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales. Wells fueron tratados con 15 medicamentos que pertenecen a tres clases mecanicistas (inhib...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Aquí se describe un flujo de trabajo para el análisis rápido y colecciones de imágenes de microscopía de fluorescencia utilizando PhenoRipper, una plataforma de análisis de imagen recientemente desarrollado explorar.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K vistas.  UT Southwestern Medical Center.  Aquí se describe un flujo de trabajo para el análisis rápido y colecciones de imágenes de microscopía de fluorescencia utilizando PhenoRipper, una plataforma de análisis de imagen recientemente desarrollado explorar. 

Video: Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Investigación

Biología

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identificación de Kinesin-1 Cargos El uso de microscopía de fluorescencia

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...