La bondad y la generosidad del Dr. Kent McDonald de la Universidad de Berkeley son muy apreciadas. Damos las gracias a un revisor anónimo de sugerencias muy útiles. El laboratorio de Burch-Smith es apoyado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Tennessee.

NOTA: El procedimiento QFS requiere extremo cuidado y precaución por el usuario y le prestamos atencion a estas precauciones de seguridad aquí como precauciones y notas en su caso. 1.Preparación para HPF Run <ol><li> Antes de comenzar la preparación de muestras, encienda el congelador de alta presión siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: La unidad HPF utilizada en este protocolo es una unidad compacta Wohlwend 02 (Figura 1), y se tarda aproximadamente una a una hora y media de procedimiento de puesta en marcha antes de HPF se ejecuta puede comenzar. <ol><li> Encender el Wohlwend compacto de alta presión 02 congelador. <ol><li> Encienda el instrumento girando el interruptor principal de &quot;0&quot; a &quot;1&quot;. </li><li> Liberar el aire comprimido a la máquina. </li><li> Liberación de nitrógeno líquido a la máquina. </li><li> Presione el botón &quot;SYSTEM DRY UP&quot;. </li><li> Después de 30 minutos, pulse el botón &quot;SYSTEBotón de nuevo M DRY UP &quot;. </li><li> Presione el botón &quot;ON / OFF&quot; para encender el instrumento. </li><li> Pulse el botón &quot;NITROGENO&quot;. </li><li> Deje que la máquina se enfríe durante 20 minutos, incluso si el &quot;DRIVE IN&quot; botón ya ha iluminado. </li><li> El &quot;DRIVE IN&quot; botón se ilumina. </li><li> Pulse el &quot;DRIVE IN&quot; botón. </li><li> Pulse el botón &quot;AUTO&quot;. </li><li> Los &quot;SISTEMA LISTO&quot; botón se ilumina. </li><li> Coloque la sonda de temperatura y de presión en la cámara de presión y fijarlo con el pasador. </li><li> Pulse el botón &quot;AUTO JET&quot;. Este paso comprueba que el aumento de presión y el descenso de la temperatura son tan deseada; esencialmente una prueba. Se espera que las fuertes caídas de temperatura y fuertes aumentos de presión (Figura 1B). </li><li> Realizar dos ciclos más JET. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparación para ReceiviLas muestras congeladas ng <ol><li> Rellena una caja aislada que contiene los titulares criovial con nitrógeno líquido (véase Advertencias de seguridad), por lo que los titulares están cubiertos completamente (Figura 1C). NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido. </li><li> Coloque el número apropiado de viales que contienen el medio FS en los soportes de tubo de aluminio en el nitrógeno líquido (Figura 1C). Con este protocolo hasta cuatro discos que contienen cada uno una sola muestra se puede colocar en una sola criovial. NOTA: Los viales deben ser etiquetados con un instrumento afilado como un escriba con punta de diamante y un lápiz muy suave. <ol><li> Para fijador durante QFS utilizar 1% OSO 4 y 0,1% de acetato de uranilo en acetona 9. Preparar la solución en gran volumen, dispensar alícuotas de 1,5 ml en crioviales y tienda de congelados en nitrógeno líquido. NOTA: los avisos de seguridad para el manejo de OsO4 y acetato de uranilo. NOTA: OsO4 </sub&gt; y acetato de uranilo son productos químicos peligrosos y deben ser manejados en la campana de extracción, mientras que use el equipo de protección personal (PPE), incluyendo zapatos cerrados, bata de laboratorio y guantes. NOTA: Los crioviales se utiliza para mantener las muestras para QFS debe tener una junta tórica duro para asegurar que los tubos se mantendrán sellados durante QFS para evitar fugas de OsO4. </li></ol></li><li> Prepare la pasta de levadura mezclando la levadura del pan, con un volumen aproximadamente igual de metanol al 10% con un palillo de dientes u otro objeto similar hasta que la pasta esté suave. La pasta de levadura actúa como un crioprotector extracelular y se utiliza para llenar el espacio alrededor de la muestra en el portamuestras. La cantidad de pasta depende del número de muestras; para 10 muestras o menos la pasta (1 ml) se pueden mezclar en un tubo de microcentrífuga. </li></ol> Congelación 3. de alta presión de las Muestras <ol><li> Quite una hoja (u otro tejido) de interés por parte de la planta y suavemente colóquelo sobre un trozo de dental de cera u otra superficie de corte. Use un punzón de 2,0 mm o tamaño deseado para cortar una muestra de la hoja. Maneje la muestra suavemente con un par de pinzas y trabajar lo más rápido posible. </li><li> Trabajando bajo un microscopio de disección, coloque el disco de hoja en el lado de 0,2 mm del tipo A portador de muestras y cubrir por completo en la pasta de levadura. Asegúrese de que el disco está completamente lleno y la pasta esté al nivel del borde del soporte al suavizar la pasta con un pincel fino (Figura 2). </li><li> Coloque el soporte en el soporte de la muestra. Cubra la muestra con la muestra portadora Tipo B, superficie plana hacia abajo. NOTA: El soporte de la muestra debe estar seco ya temperatura ambiente. </li><li> Toma de muestras en el soporte de muestra; poner en la máquina e iniciar un ciclo de congelación presionando el botón &quot;AUTO JET&quot;, que debe completar en un segundo o dos. </li><li> Trabajar lo más rápido posible, retire el soporte de la máquina y colocar la punta de la celebración de la sample en nitrógeno líquido en la caja aislada en la parte superior de la máquina HPF. Sumergir las puntas de dos pares de pinzas en el nitrógeno líquido para enfriar ellos. NOTA: Después de la congelación, los transportistas sólo deben ser manipulados con pinzas de nitrógeno líquido refrigerado. (Temperatura ambiente) pinzas calientes son a menudo la causa de la falla en cryotechniques. </li><li> Abra una criovial que contiene los medios de comunicación FS, y coloque la tapa en el lado de la caja. Con la ayuda de un par de fórceps enfriado con nitrógeno líquido, eliminar suavemente el disco de la portamuestras, asegurándose de que el disco está siempre en el nitrógeno líquido o vapor. Trabajar en el vapor de nitrógeno líquido, sostenga el tubo FS con uno fórceps pre-enfriado y utilizar la otra para colocar el soporte en el vial FS. Tornillo de la tapa del vial FS de nuevo. No cualquier trampa de nitrógeno líquido en el vial. NOTA: Cuando se transfieren las muestras a crioviales de QFS, garanticen que ninguna de nitrógeno líquido queda atrapado en los viales. El nitrógeno líquido se expande 700 veces durante el calentamiento y cualquier trapped nitrógeno líquido puede causar explosiones durante este tiempo. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.7 hasta que se congelan todas las muestras deseadas. Discos de hojas múltiples que contienen el mismo tipo de muestra se pueden colocar en el mismo vial. Tenga en cuenta que el soporte de la muestra tiene que ser secado y se llevó a temperatura ambiente, entre carreras de congelación. Para hacer esto de manera rápida, calentarlo con un secador de pelo, y controlar su temperatura por medio del tacto. </li></ol> 4 Preparación para Congelar Sustitución <ol><li> Inmersa por completo el bloque calentador de aluminio en nitrógeno líquido durante 10 minutos o hasta que deje de ebullición nucleada. Mientras esto sucede, coloque una capa de hielo seco (1-2 cm) en la parte inferior del recipiente utilizado como cámara de FS (Figura 3). Un recipiente de espuma de poliestireno o cubo de hielo se pueden utilizar para FS, junto con pellets de hielo seco o aplastado. </li><li> Inserte rápidamente los crioviales que contienen las muestras junto con la sonda de temperatura en las filas centrales del bloque del calentador. Asegúrese de que las tapas de laviales están firmemente atornillados de manera que los medios de comunicación FS no se escape durante la FS. Comience a registrar la temperatura. <ol><li> Hacer la sonda de temperatura mediante la colocación de un termopar a través de la parte superior de un criovial para que llegue a la parte inferior del tubo. Sellar la tapa del tubo con resina de forma que no haya fugas de líquido fuera. Llenar el tubo con 1,5 ml de acetona al inicio de cada ejecución QFS. </li></ol></li><li> Usando cryogloves aislados o grandes pinzas, derramará todo el nitrógeno líquido desde el bloque del calentador. Tenga cuidado de no derramar los crioviales. NOTA: Use PPE incluyendo cryogloves y gafas al manipular el nitrógeno líquido. </li><li> Coloque el bloque que contiene los viales sobre la capa de hielo seco en la cámara de QFS. Asegúrese de que el bloque se coloca de manera que los tubos están en posición horizontal pero con una ligera inclinación hacia arriba. No debe haber fugas si se utilizan los crioviales correctos. </li><li> Empaque la cámara de QFS con hielo seco de manera que los tubos FS están cubiertos, aunque no es necesariocubrir la parte superior del bloque. Coloque la tapa en la cámara. </li></ol> 5. FS Rápida NOTA: Realice la carrera QFS en una campana de humos en caso de que cualquier fuga de OsO4 ocurre inadvertidamente a pesar de otras precauciones. <ol><li> Coloque cámara de QFS en un agitador rotatorio plataforma en una campana de humos y girar a 125 rpm durante 120 min. Durante este tiempo la temperatura del bloque debe aumentar gradualmente a aproximadamente -80 ° C. La agitación se asegura la mezcla de los componentes de mejores FS. NOTA: La colocación de la coctelera en la campana de humos y la posición de la puerta campana de humos debe ser la misma durante todo el procedimiento QFS y por cada QFS ejecutar para asegurar el calentamiento consistente de muestras. </li><li> Retire el hielo seco de la cámara y continuar agitando durante otra hora. NOTA: la temperatura debe aumentar a alrededor de -15 ° C a -20 ° C. </li><li> Retire las muestras y la sonda de temperatura de la cámara de QFS y colocarlo en elagitador a temperatura ambiente durante otros 10-15 minutos, hasta que alcancen la temperatura ambiente. Detener la grabación de la temperatura. </li><li> Durante FS, apague la máquina de HPF. <ol><li> Cierre la llave del tanque de nitrógeno líquido, mientras que la máquina de HPF se llena con nitrógeno. </li><li> Pulse el botón &quot;NITROGENO&quot;. </li><li> Espere hasta que los rojos &quot;pistón hacia abajo&quot; se apaga la luz. </li><li> Presione el botón &quot;ON / OFF&quot;. </li><li> Presione el botón &quot;SYSTEM DRY UP&quot;. </li><li> Corte el suministro de aire comprimido para la máquina. </li><li> Después de un mínimo de 12 horas (para asegurar el secado de la humedad), apague la máquina girando el interruptor principal de &quot;1&quot; a &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6. Mensaje FS Procesamiento <ol><li> Retire con cuidado los medios de comunicación FS con pipetas de transferencia de plástico y colocar en el recipiente apropiado para desechos tóxicos. NOTA: OsO4 y acetato de uranilo son productos químicos peligrososy debe ser manejado en la campana de extracción, mientras que use el equipo de protección personal (PPE), incluyendo zapatos cerrados, bata de laboratorio y guantes. </li><li> Lávese las muestras cuatro veces con acetona al 100%. Recoge los dos primeros lavados y colocarlo en el contenedor de residuos tóxicos. </li><li> Con unas pinzas finas, eliminar las muestras de tejido de los titulares. Mantener las muestras mojado con acetona como se hace esto, y trabajar con mucho cuidado para evitar romper las muestras. NOTA: No es inusual y que en realidad puede ser útil disponer de la pasta de levadura se alejan de las muestras en este punto. La pasta de levadura es generalmente de color marrón muy oscuro, mientras que el tejido de la hoja aún está verde. </li><li> Recoger las muestras en crioviales que contienen acetona. Proceder a la preparación de muestras (infiltración y la incrustación) para TEM de acuerdo a los protocolos habituales. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El éxito del protocolo que se presenta aquí depende en gran medida del usuario. En primer lugar, se requiere una preparación avanzada para asegurar que todos los materiales necesarios son fácilmente disponibles y en cantidad suficiente para completar toda una carrera HPF-QFS. En segundo lugar, el usuario debe trabajar con rapidez, moviéndose desde el paso-a-paso de una manera eficiente que minimiza la manipulación de la muestra, minimizando de este modo los cambios en el estado nativo del tejido. Una vez que las m...

Nuestro conocimiento de la ultraestructura de células proviene principalmente de microscopía electrónica, que puede resolver detalles en el intervalo de unos pocos nanómetros 1. A pesar de ser tan poderoso en la resolución TEM no se considera fácil de usar, como preparación de la muestra requiere mucho tiempo y protocolos laboriosas, y exige cierta experiencia del practicante. Fijación tradicional de las muestras ha combinado el uso de aldehídos y tetróxido de osmio antes del procesamiento adicional que incluye la deshidratación, incrustación de resina y luego en seccionar para producir secciones ultra-delgada que se tiñen con metales pesados. Sin embargo, se sabe que la fijación química puede producir artefactos incluyendo la agregación de proteínas y la pérdida de lípidos 1, y cambios a las membranas que afectan en última instancia varios compartimentos celulares 2. Estos artefactos se atribuyen en gran parte a la lenta tasa de fijación y deshidratación a temperatura ambiente 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Criofijación por alta presión congelación (HPF) evita la mayoría de los artefactos causados ​​por la fijación química. El principio de criofijación es que disminuye el punto de congelación del agua por 20 grados, se ralentiza la nucleación y crecimiento de cristales de hielo y aumenta la viscosidad del agua en una muestra biológica de modo que los constituyentes celulares son esencialmente inmovilizadas 6, 7. HPF disminuye un la temperatura de la muestra a la de nitrógeno líquido, a muy alta presión (210 MPa o 2.100 bar) en milisegundos. Cuando se hace correctamente HPF previene la formación de grandes cristales de hielo que pueden causar grandes daños a ultraestructura celular. HPF se puede utilizar para fijar muestras de 100-200 micras de espesor en concentraciones típicas de solutos biológicos 7. Hay numerosas opiniones sobre la física y los principios subyacentes HPF, por ejemplo, 1, 7, 8. Después de HPF, las muestras se incubaron a temperatura baja (-78,5 ° C a -90 y# 176; C) en presencia de disolvente que contiene fijadores químicos líquidos orgánicos como tetróxido de osmio, generalmente para unos pocos días. A esta baja temperatura, el agua en la muestra se sustituye por el disolvente orgánico, típicamente acetona o metanol 1, 9. Por lo tanto, este proceso se denomina sustitución de congelación (FS). La muestra se calentó gradualmente y durante este tiempo se fija, por lo general con tetróxido de osmio y acetato de uranilo 9. La reticulación a bajas temperaturas tiene la ventaja de la fijación de moléculas que están inmovilizadas 1. FS, por tanto, produce muestras de calidad superior en comparación con los fijados por la fijación química convencional a temperatura ambiente, en particular, que resulta en una mejor conservación ultraestructural, mejor conservación de la antigenicidad y la reducción de la pérdida de los componentes celulares no unidas 10, 11. La mayoría de FS se lleva a cabo durante períodos de tiempo largos, normalmente de hasta varios días. Esto es particularmente true para las plantas muestras 12, 13, 14. Un reciente protocolo desarrollado por McDonald y Webb reduce en gran medida el tiempo de FS desde varios días hasta unas pocas horas 15. En su procedimiento de rápida sustitución de congelación (QFS), FS se lleva a cabo más de 3 horas, mientras que en el FS súper rápidas (SQFS) muestras se procesan en 90 minutos. La calidad de las muestras producidas por estos métodos es comparables a los generados por los protocolos de FS tradicionales. Hemos adoptado el protocolo QFS para el procesamiento posterior de las muestras de plantas después de HPF. Esto ha demostrado ahorrar no sólo tiempo, sino también dinero, como QFS y SQFS utilizan equipos de laboratorio común en lugar de las costosas máquinas FS disponibles comercialmente. Los tejidos vegetales son a menudo muy difícil de preparar para TEM. En promedio, las células vegetales son más grandes que cualquiera de las células bacterianas o de animales. La presencia de cutícula cerosa hidrófobo, paredes celulares gruesas, grandes vacuolas llenas de agua que contienen ácidos orgánicos, hidrolasas y c fenólicocomuestos que pueden ocupar hasta el 90% del volumen total de células 16, y la presencia de espacios aireados disminuye gravemente la conductividad de calor del sistema 17. Además, en el caso de las plantas, el espesor de la muestra casi siempre supera 20 m, el límite para el uso de la fijación química. En estos espesores, la baja conductividad de calor de agua evita una tasa de congelación más de -10 000 ° C / seg en el centro de la muestra. Se requiere que la tasa para evitar la formación de hielo hexagonal perjudicial (cristales de hielo con una densidad más baja y más grande que de 10 a 15 nm) 8. Juntos, estos presentan desafíos tanto a congelación adecuada de la muestra y FS posteriores. No obstante, criofijación es el mejor método para la fijación de muestras de plantas. Aquí se presenta un protocolo para HPF-QFS de muestras de tejidos vegetales. Se centra en la especie modelo Arabidopsis thaliana, pero también se ha utilizado con Nicotiana benthamiana. Los resultados típicos demuestran que HPF-QFS produce samples de calidad comparable a la tradicional HPF-FS en una fracción del tiempo. Con los ajustes adecuados, este protocolo puede usarse también para otras muestras biológicas relativamente gruesas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

Dado que el microscopio electrónico de transmisión de 1940 (TEM) ha estado proporcionando los biólogos con imágenes ultra-alta resolución de los materiales biológicos. Sin embargo, debido a los protocolos laboriosos y lentos que también exigen experiencia en la preparación de las muestras libres de artefactos, TEM no se considera una técnica fácil de usar. Preparación de la muestra tradicional para TEM utiliza fijadores químicos para preservar las estructuras celulares. Congelación de alta presión es la criofijación de muestras biológicas bajo altas presiones para producir velocidades de enfriamiento muy rápidas, restringiendo así la formación de hielo, que es perjudicial para la integridad de la ultraestructura celular. Congelación de alta presión y la sustitución de congelación son actualmente los métodos de elección para la producción de la morfología de la más alta calidad en las secciones de resina para TEM. Estos métodos reducen al mínimo los artefactos normalmente asociados con el procesamiento convencional para TEM de secciones delgadas. Después de criofijación el agua congelada en la muestra se sustituye con el líquidodisolvente orgánico a bajas temperaturas, un proceso llamado sustitución de congelación. Sustitución Freeze se lleva a cabo normalmente durante varios días en dedicado, equipos costosos. Una reciente innovación permite que el proceso se completará en tres horas, en lugar de los habituales dos días. Esto es seguido por varios días más de preparación de la muestra que incluye la infiltración y la incrustación en resinas epoxi antes de seccionar. Aquí se presenta un protocolo que combina la congelación de alta presión y la sustitución de congelación rápida que permite la fijación de la muestra planta para llevar a cabo en cuestión de horas. El protocolo puede adaptarse fácilmente para trabajar con otros tejidos u organismos. Los tejidos vegetales son de especial preocupación debido a la presencia de espacios aireados y vacuolas llenas de agua que impiden la congelación sin hielo de agua. Además, el proceso de fijación química es especialmente larga en las plantas debido a las paredes celulares que impiden la penetración de los productos químicos a lo profundo dentro de los tejidos. Los tejidos de plantas son, por lo tanto particcialmente difícil, pero este protocolo es confiable y produce muestras de la más alta calidad.

Los resultados presentados a continuación han sido obtenidos utilizando un Wohlwend compacto 02 para HPF (Figura 1A). Una gran ventaja de este instrumento es la facilidad de uso de los portadores de muestra y sus titulares. Si se utilizan otros instrumentos, McDonald recomienda que dos usuarios deben llevar a cabo la preparación de la muestra y HPF, una preparación de las muestras, mientras que el otro hace la congelación y traslado al FS crioviales 9. Sin embargo, la Wohlwend espécimen ...

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K vistas.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Investigación

Biología

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.