El protocolo FASP es un enfoque interesante para la proteómica urinaria debido a su compatibilidad con búferes fuertemente desnaturalización y debido a su capacidad para concentrar la muestra en el filtro, que es crítico para una muestra de proteína diluida. El protocolo FASP, junto con la espectrometría de masas de análisis independiente de datos, nos permite lograr una cobertura profunda de proteoma en EPS-orina, que es orina recogida después del examen rectal digital. Actualmente estamos aplicando el método que está a punto de ver en un esfuerzo de descubrimiento de biomarcador sobre el cáncer de próstata.
El procedimiento será mostrado por Licia Prestagiacomo, Paola Morelli y Caterina Gabriele. Centrífuga muestras de EPS-orina dentro de las dos horas posteriores a la recolección durante 10 minutos a 2.100 RCF a temperatura ambiente. A continuación, guarde los sobrenadantes a menos 80 grados centígrados hasta su uso.
Tire las muestras sobre hielo, o a cuatro grados. Para acelerar el procedimiento, puede transferir las muestras de menos 80 a menos 20 el día anterior a la digestión. Como soluciones de stock, necesitará 500 TDT milimolar, 10% SDS, un búfer Tris molar en pH ocho.
Diluir 500 microlitros de cada muestra de EPS-orina con 67 microlitros de SDS, 67 microlitros de TDT y 33 microlitros de tampón Tris. Incubar a 95 grados centígrados durante 10 minutos con suave temblor. Monte la unidad de filtro centrífugo con un peso molecular dalton de 10.000 Dalton cortado.
A continuación, agregue 300 microlitros de muestra de EPS-orina diluida al filtro. Centrífuga a 14.000 g durante aproximadamente 20 minutos. Puede interrumpir temporalmente el procedimiento después de 15 minutos más o menos para comprobar si la filtración se está llevando a cabo sin problemas.
Continúe hasta que toda la solución haya pasado por el filtro. A continuación, añadir 200 microlitros de búfer de urea y centrífuga a 14.000 g durante 15 minutos. Repita este paso por segunda vez.
Cuando el flujo esté a punto de tocar el filtro, vacíe la colección Eppendorf canalizando el flujo a través. Las proteínas son seguras en el filtro. Para la alquilación de cisteína, prepare una solución de iodoacetamida inmediatamente antes de su uso.
Pesar alrededor de 10 miligramos de iodoacetamida en un vial de Eppendorf número y disolverlo en búfer de urea a una concentración de 9,25 miligramos por ml, o en términos de molaridad, 50 milmolar. Añadir 50 microlitros de solución de iodoacetamida a cada filtro y centrífuga a 6.000 g durante 25 minutos. La velocidad de centrifugación más baja permitirá que los filtros no se sequen.
Después de la alquilación proteica, lave los filtros con dos aliquots de 200 microlitros consecutivos de amortiguador de urea y centrífuga a 14.000 g durante 20 minutos. Deseche el flujo. Añadir 200 microlitros de 50 mililitros tres tampón de bicarbonato de etil ammonio y centrífuga a 14.000 g durante 20 minutos.
Repita este paso. Después de completar completamente el último lavado de bicarbonato, transfiera la unidad de filtro a un nuevo tubo de recogida. A continuación, agregue 60 microlitros de 50 mililitros de TAMP TEAB.
Añadir un microlitro de solución de trippsina a una concentración de 200 nanogramos por microlitro de trippsina. Alternativamente, puede preparar el búfer de digestión para todas las muestras en un vial de Eppendorf y distribuir 61 microlitros del búfer de digestión a cada filtro. Si está utilizando un ThermoMixer para evitar la evaporación de muestras durante la incubación nocturna, envuelva cada unidad de filtro con una capa de papel de aluminio y, a continuación, una capa de parafilm.
Incubar las muestras a 37 grados durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera los filtros a una centrífuga superior del banco para un giro muy corto. Después de girar, abra las tapas de Eppendorf y agregue 140 microlitros de agua.
Centrífuga los viales a 14.000 g durante 25 minutos, con el fin de recoger los péptidos. El volumen recogido debe ser de alrededor de 190 microlitros. Para eliminar las trazas de SDS del resumen, se recomienda la purificación fuerte del intercambio de cationes de los péptidos antes de LC-MS-MS.
Prepare los porta microcolumnos perforando tapas Eppendorf con una herramienta afilada como un par de pinzas o tijeras. El soporte acomodará la microcolumn durante la centrifugación. Dado que son tediosos para prepararse, los titulares pueden ser utilizados varias veces.
Con un contundente y una aguja, retire una placa del disco de extracción adecuado. Los discos de extracción son materiales poliméricos blandos que contienen partículas de sorbente. En este caso, el sorbente está hecho de partículas con fuertes propiedades de intercambio de catión.
Coloque la placa en una punta de pipeta de 200 microlitros. Con un pistón empuje el enchufe hacia el final de la punta. El disco pequeño debe ser empujado firmemente, pero evitando una fuerza excesiva.
Inserte la punta en el soporte y monte la microcolumna de espín utilizando un vial Eppendorf de dos mililitros del que se extrajo la tapa original. El enchufe de una aguja calibre 16 tendrá una capacidad de carga de unos cinco microgramos de péptidos. Condicionar la microcolumna con dos lavados consecutivos.
La velocidad adecuada dependerá de la fuerza con la que empuje el disco en la punta de la pipeta. Aspirar a lograr un caudal del orden de 20 a 30 microlitros por minuto. Trate de no tener la punta seca durante los lavados y durante la carga de la muestra.
Diluya la muestra cinco veces en la solución de lavado dos y cargue los resultados en solución a una velocidad más lenta. Aspirar a un caudal de aproximadamente 15 a 20 microlitros por minuto. Si es necesario, deseche el flujo.
Lave los detergentes residuales. A continuación, deje que el disco se seque antes de la elución peptídica. Transfiera la microcolumna a un tubo Eppendorf limpio de 1,5 e inmediatamente agregue el eluent.
Que serán siete microlitros de una solución de acetato de amonio de 500 milmolar que contiene 20% acetonitrilo. Diluir el eluato con 27 microlitros de ácido formónico del 0,1% con el fin de reducir el porcentaje de disolvente orgánico y luego inyectar dos microlitros de la solución resultante en LC-MS-MS con detección en modo dependiente de datos. Los detalles sobre la configuración LC-MS utilizada en este protocolo se darán más adelante en el video.
Después de realizar la búsqueda de base de datos y la integración de errores de péptido, calcule el área de pico general. A continuación, compárela con una curva estándar externa para estimar la concentración de péptidos en el resumen FASP. Después de estimar la cantidad de péptidos, purifique una nueva alícuota de digestión FASP correspondiente a dos microgramos de péptidos por dos purificaciones consecutivas de la punta de escenario como se describe aquí.
La configuración LC-MS utilizada en este protocolo se basa en la inyección directa en la columna analítica. Si está utilizando un sistema con una columna de captura, puede evitar el paso de la purificación C18 sin conexión. Recuerde utilizar agujas y pistones dedicados para cada material cromatatográfico.
Después de eluir los péptidos de la punta de etapa C18 con 10 microlitros de eluent, evaporar parcialmente el eluato en una centrífuga de vacío durante unos minutos, tratando de evitar la evaporación completa. A continuación, agregue 47 microlitros de ácido formónico al 0,1% y coloque la solución resultante en un vial HPLC para el análisis de LC-MS. El sistema utilizado aquí se basa en la carga directa de muestras de columna sin utilizar una columna de reventado.
Las columnas analíticas se hacen internamente tirando de un capilar de identificación de 75 micrómetros después de quitar un pedazo de recubrimiento de poliamida. La punta resultante puede tener una forma suave con una cortadora de cerámica. A continuación, el capilar se coloca en una bomba de embalaje y se llena con un lodo isopropanol de 50 miligramos por ml de partículas de fase estacionaria C18 de tres micrómetros.
Se necesita una presión de gas de entre 10 y 20 barras de nitrógeno o helio. Puede utilizar columnas de cromatografía alternativas o comerciales que se ejecutan en submicrobítro por velocidad de flujo de minutos. Ensamblar la columna en una pieza en T.
Los otros dos extremos están conectados a la fuente de alimentación de alto voltaje y al bucle HPLC. Evalúe la tensión óptima de pulverización ejecutando el sistema a flujo isocrático. A continuación, comience su análisis.
Separe los péptidos en un degradado cromatografía de dos horas de duración como se muestra. La adquisición de datos consistirá en un análisis rápido completo del servicio de EM seguido de 26 exploraciones de MS-MS en ventanas precursoras de ancho variable. A partir de 20 m/z de ancho, para las primeras 20 ventanas que cubrirán un rango m/z de 350 a 750 Thompson.
A continuación, pasar a un ancho de 50 m/z para las siguientes cinco ventanas y terminar con un único análisis de MS-MS, con un ancho de aislamiento de 200 Thompson. Los anchos más estrechos representan una región más poblada del espectro en términos de presencia de precursores de péptidos. Para el análisis DIA necesitará una biblioteca espectral.
Para generar una biblioteca espectral, puede realizar algunos experimentos dependientes de datos en el mismo sistema LC-MS-MS que ha estado utilizando para la adquisición de DIA utilizando el mismo degradado de cromatografía. El fraccionamiento de muestras aumentará la cobertura de proteoma. Las puntas de etapa se pueden utilizar para el fraccionamiento de muestras.
El intercambio de catión fuerte y la fase inversa básica son dos alternativas válidas. Comience con los 10 microgramos de un grupo de varios digeridos FASP. Acidifique la muestra utilizando una concentración final de 0,2% TFA.
Cargue los péptidos en puntas de etapa C18 de alta capacidad. Utilice varios discos en caso de grandes cantidades de péptidos. Para 10 microgramos de material, se recomiendan dos discos.
Realice la purificación C18 como se describió anteriormente. Preparar varios viales para la recolección de eluate. Tantos como el número de fracciones.
En este caso 10 fracciones se producen por elución escalonada. Después del último lavado, agregue 20 microlitros del primer eluent. 0,2% hidróxido de amonio, 10 mililitros TEAB, 4% acetonitrilo.
Después de elutar completamente la primera fracción en el primer Eppendorf, mueva la punta del escenario al siguiente vial de recogida. Diluir en 20 pasos de microlitro utilizando como eluent, 0.2% de hidróxido de amonio, 10 mililitros TEAB, y luego aumentar la cantidad de acetonitrilo. Después de fraccionar el ejemplo y ejecutar experimentos dependientes de datos en cada fracción, genere la biblioteca espectral mediante la búsqueda de datos de MS-MS.
A continuación, la biblioteca se importará en un software capaz de análisis de datos DIA para cuantificación de proteínas basado en un mínimo de un péptido único asignado por un mínimo de tres transiciones. Espere cubrir una amplia gama del proteoma urinario. Esta cifra muestra la identificación y cuantificación de proteínas en un rango de abundancia, que abarca cinco órdenes de magnitud.
El flujo de trabajo aquí presentado combina la ventaja de concentración y la versatilidad del protocolo FASP con la sensibilidad del modo de escaneo DIA. Esta combinación proporciona un mapa enriquecido del proteoma urinario. Dado que nuestra configuración de análisis no incluye el uso de una columna de captura, el resumen FASP fue purificado tanto por el intercambio de catión fuerte como por las puntas de etapa de fase invertida.
El paso Sugerencias de etapa de fase invertida se puede omitir cuando una columna de reventado está conectada directamente a la columna analítica. El uso de este flujo de trabajo se recomienda para analizar muestras de EPS-orina, pero su uso se puede extender a la proteómica urinaria en general.
